(ES) č. 152/2009Nařízení Komise (ES) č. 152/2009 ze dne 27. ledna 2009 , kterým se stanoví metody odběru vzorků a laboratorního zkoušení pro úřední kontrolu krmiv (Text s významem pro EHP)

---

PŘÍLOHA I

METODY ODBĚRU VZORKŮ

1.   ÚČEL A OBLAST POUŽITÍ

Vzorky určené pro úřední kontrolu krmiv se odeberou podle níže popsaných metod. Takto získané vzorky se považují za reprezentativní pro vzorkované partie.

Účelem odběru reprezentativních vzorků je získat malou frakci z šarže takovým způsobem, aby stanovení jakékoli konkrétní vlastnosti této frakce odpovídalo střední hodnotě vlastnosti šarže. Šarže se vzorkuje opakovaným odběrem dílčích vzorků v různých místech šarže. Tyto dílčí vzorky se spojí smícháním tak, aby vznikl jeden souhrnný vzorek, z něhož se reprezentativním dělením připraví konečné reprezentativní vzorky.

Pokud na základě vizuální kontroly či jiných relevantních informací vykazují partie krmiva, které mají být vzorkovány, odlišnost v kvalitě od zbytku krmiva z téže šarže, oddělí se tyto partie od zbytku krmiva a zachází se s nimi jako se samostatnou dílčí šarží. Pokud není možné rozdělit krmivo do samostatných dílčích šarží, vzorkuje se krmivo jako jedna šarže. V takových případech se tato skutečnost uvede do protokolu o odběru vzorku.

Je-li krmivo vzorkované v souladu s ustanoveními tohoto nařízení označeno jako krmivo, které nesplňuje požadavky EU, a je-li částí šarže krmiva stejné třídy nebo popisu, má se za to, že všechno krmivo dané šarže vykazuje stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

Odběr vzorků může rovněž zahrnovat krmiva, která provozovatelé krmivářských podniků nabízejí k prodeji komunikačními prostředky na dálku v souladu s čl. 11 odst. 3 nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 767/2009 ( 4 ). Odběr vzorků krmiv nabízených k prodeji komunikačními prostředky na dálku se v zásadě uskutečňuje podle bodů uvedených v této příloze. Zvláštní aspekty odběru vzorků prodeje na dálku jsou popsány v bodě 11.

2.   DEFINICE

3.   OBECNÁ USTANOVENÍ

Značka pečeti by měla být jednoznačně identifikovatelná a jasně viditelná.

4.   PŘÍSTROJE

4.1.   Přístroje určené k odběru vzorků musí být vyrobeny z materiálů, které nemohou kontaminovat produkty, u nichž má být odběr vzorků proveden. Přístroje, které jsou určeny k opakovanému použití, musí být snadno čistitelné, aby se zamezilo křížové kontaminaci.

4.2.    Přístroje doporučené pro odběr vzorků pevných krmiv

4.2.1.    Ruční odběr vzorků

V případě, že má vzorkovač několik otvorů, měly by být pro zajištění odběru na různých místech podél vzorkovače otvory prostorově odděleny nebo pravidelně rozloženy.

4.2.2.    Mechanický odběr vzorků

Pro odběr vzorků krmiva v pohybu lze použít vhodná mechanická zařízení. Mechanické zařízení se považuje za vhodné, pokud odebírá vzorek alespoň z celé sekce pohybu krmiva.

Odběr vzorků z krmiva v pohybu (při silném průtoku) lze provádět automatickými vzorkovači.

4.2.3.    Dělič

Pokud je to možné a vhodné, měl by se při přípravě reprezentativních redukovaných vzorků používat přístroj určený k dělení vzorků do přibližně stejných částí.

5.   KVANTITATIVNÍ POŽADAVKY NA POČET DÍLČÍCH VZORKŮ

5.1.    Kvantitativní požadavky na dílčí vzorky v souvislosti s kontrolou látek nebo produktů rozložených v krmivu rovnoměrně

5.1.1.    Volně ložené pevné krmivo

5.1.2.    Volně ložené tekuté krmivo

5.1.3.    Balené krmivo

Krmivo (pevné i tekuté) může být baleno v pytlích, plechovkách, barelech atd., které se v tabulce níže označují jako balení. Odběr vzorků z velkých balení (≥ 500 kg nebo litrů) musí být prováděn v souladu s ustanoveními platnými pro volně ložené krmivo (viz body 5.1.1 a 5.1.2).

5.1.4.    Krmiva v blocích a minerální lizy

Nejméně jeden blok nebo liz ke vzorkování na jednu vzorkovanou partii obsahující 25 jednotek, maximálně čtyři bloky nebo lizy.

V případě bloků nebo lizů o hmotnosti nejvýše jeden kg se za dílčí vzorek považuje obsah jednoho bloku nebo jednoho lizu.

5.1.5.    Objemná krmiva/pícniny

5.2.    Kvantitativní požadavky na dílčí vzorky v souvislosti s kontrolou složek nebo látek, které jsou v krmivu pravděpodobně rozloženy nerovnoměrně

Tyto kvantitativní požadavky na dílčí vzorky se použijí v těchto situacích:

V případě, že má kontrolní orgán silné podezření, že k tomuto nerovnoměrnému rozložení dochází také v případě křížové kontaminace některou ze složek nebo látkou v krmných směsích, mohou se uplatnit kvantitativní požadavky stanovené v tabulce níže.

5.3.    Kvantitativní požadavky na dílčí vzorky v případě velmi velkých šarží

V případě velkých vzorkovaných partií (vzorkované partie o hmotnosti > 500 tun) se počet dílčích vzorků, které mají být odebrány, rovná součtu 40 dílčích vzorků + √ tun v souvislosti s kontrolou látek nebo produktů rozložených v krmivu rovnoměrně nebo 100 dílčích vzorků + √ tun v souvislosti s kontrolou složek nebo látek, které jsou v krmivu pravděpodobně rozloženy nerovnoměrně.

6.   KVANTITATIVNÍ POŽADAVKY NA SOUHRNNÝ VZOREK

Požaduje se jeden souhrnný vzorek na jednu vzorkovanou partii.

7.   KVANTITATIVNÍ POŽADAVKY NA KONEČNÉ VZORKY

Konečné vzorky

Požaduje se provedení analýzy alespoň u jednoho konečného vzorku. Množství v konečném vzorku pro analýzu nesmí být nižší než:

8.   METODA ODBĚRU VZORKŮ PRO VELMI VELKÉ ŠARŽE NEBO ŠARŽE SKLADOVANÉ NEBO PŘEPRAVOVANÉ TAK, ŽE ODBĚR VZORKŮ V CELÉ ŠARŽI NENÍ PROVEDITELNÝ

8.1.    Obecné zásady

V případě, že způsob přepravy nebo skladování šarže neumožňuje odběr dílčích vzorků z celé šarže, měl by se odběr z těchto šarží pokud možno provádět tehdy, když je šarže v pohybu.

V případě velkých skladů určených ke skladování krmiv by měli být provozovatelé nabádáni, aby do skladu nainstalovali zařízení, které umožní (automatický) odběr vzorků z celé skladované šarže.

V případě uplatňování postupů odběru vzorků stanovených v tomto bodě se o postupu odběru vzorků informuje provozovatel krmivářského podniku nebo jeho zástupce. V případě, že provozovatel krmivářského podniku nebo jeho zástupce tento postup odběru vzorků zpochybní, umožní provozovatel krmivářského podniku nebo jeho zástupce příslušnému orgánu odběr vzorků z celé šarže na náklady provozovatele.

8.2.    Velké šarže přepravované lodí

8.2.1.    Dynamický odběr vzorků z velkých šarží přepravovaných lodí

Odběr vzorků z velkých šarží na lodích se pokud možno provádí tehdy, když je produkt v pohybu (dynamický odběr vzorků).

Odběr vzorků se provádí po nákladových prostorech (jednotka, kterou lze fyzicky oddělit). Nákladové prostory se však částečně jeden po druhém vyprazdňují, takže počáteční fyzické oddělení po přesunu do skladovacího zařízení již neexistuje. Odběr vzorků lze proto provádět při počátečním fyzickém oddělování nebo při oddělování po přesunu do skladovacího zařízení.

Vykládka lodi může trvat několik dní. Odběr vzorků musí být za běžných okolností prováděn v pravidelných intervalech po celou dobu trvání vykládky. Přítomnost úředního inspektora za účelem odběru vzorků po celou dobu vykládky však není vždy možná nebo vhodná. Je proto možné provést odběr vzorků u části (vzorkovaná partie) celé šarže. Počet dílčích vzorků se stanoví s přihlédnutím k velikosti vzorkované partie.

V případě, že se vzorky odebírají z části šarže krmiva stejné třídy nebo popisu a že bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, že všechno krmivo v dané šarži vykazuje stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

Přítomnost inspektora je nezbytná, i když se úřední vzorek odebírá automaticky. Avšak v případě, že za účelem zabránění podvodům probíhá automatický odběr vzorků s předem stanovenými parametry, které nelze během odběru změnit, a že jsou dílčí vzorky odebírány do zapečetěné nádoby, je přítomnost inspektora nutná pouze na počátku odběru vzorků, dále pokaždé, kdy je nutno vyměnit nádobu se vzorky, a na konci odběru vzorků.

8.2.2.    Statický odběr vzorků z šarží přepravovaných lodí

V případech, kdy je odběr vzorků prováděn statickým způsobem, se musí použít stejný postup jako pro shora přístupná skladovací zařízení (sila) (viz bod 8.4.1).

Odběr vzorků se musí provádět na (shora) přístupné části šarže/nákladového prostoru. Počet dílčích vzorků se stanoví s přihlédnutím k velikosti vzorkované partie. V případě, že se vzorky odebírají z části šarže krmiva stejné třídy nebo popisu a že bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, že všechno krmivo v dané šarži vykazuje stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

8.3.    Odběr vzorků z velkých šarží uložených ve skladech

Odběr vzorků se musí provádět na přístupné části šarže. Počet dílčích vzorků se stanoví s přihlédnutím k velikosti vzorkované partie. V případě, že se vzorky odebírají z části šarže krmiva stejné třídy nebo popisu a že bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, že všechno krmivo v dané šarži vykazuje stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

8.4.    Odběr vzorků ze skladovacích zařízení (sil)

8.4.1.    Odběr vzorků ze (snadno) shora přístupných sil

Odběr vzorků se musí provádět na přístupné části šarže. Počet dílčích vzorků se stanoví s přihlédnutím k velikosti vzorkované partie. V případě, že se vzorky odebírají z části šarže krmiva stejné třídy nebo popisu a že bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, že všechno krmivo v dané šarži vykazuje stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

8.4.2.    Odběr vzorků ze shora nepřístupných sil (uzavřených sil)

8.4.2.1.    Shora nepřístupná sila (uzavřená sila) o velikosti > 100 tun

Odběr vzorků krmiva skladovaného v těchto silech nelze provádět statickým způsobem. Pokud je třeba odebrat vzorky krmiva v takovém silu a není možné jeho obsah přemístit, je třeba se dohodnout s provozovatelem, že je povinen informovat inspektora o tom, kdy bude silo vykládáno, a umožnit mu odběr vzorků, až bude krmivo v pohybu.

8.4.2.2.    Shora nepřístupná sila (uzavřená sila) o velikosti < 100 tun

Při odběru vzorků se postupuje tak, že se 50 až 100 kg krmiva upustí do nádoby a z ní se odebere vzorek. Velkost souhrnného vzorku odpovídá celé šarži a počet dílčích vzorků se řídí množstvím krmiva upuštěného ze sila do nádoby pro účely odběru vzorků. V případě, že se vzorky odebírají z části šarže krmiva stejné třídy nebo popisu a že bylo zjištěno, že tato část šarže nesplňuje požadavky EU, předpokládá se, že všechno krmivo v dané šarži vykazuje stejné vlastnosti, pokud důkladné šetření neprokáže, že neexistují důkazy o tom, že zbytek šarže nesplňuje požadavky EU.

8.5.    Odběr vzorků krmiva volně loženého ve velkých uzavřených kontejnerech

Vzorky z těchto šarží lze často odebírat pouze při vykládce. V některých případech není vyložení v místě dovozu nebo kontroly možné, a odběr vzorků by proto měl proběhnout ve chvíli, kdy se tyto kontejnery vykládají.

9.   POKYNY TÝKAJÍCÍ SE ODBĚRU, PŘÍPRAVY A BALENÍ VZORKŮ

9.1.    Obecně

Vzorky musí být odebrány a připraveny bez zbytečného prodlení a musí být učiněna nutná předběžná opatření pro zajištění toho, aby produkt nebyl pozměněn či kontaminován. Nástroje, plochy a nádoby na vzorky musí být čisté a suché.

9.2.    Dílčí vzorky

Odběry dílčích vzorků se musí provádět náhodně a rovnoměrně v celé vzorkované partii a velikost dílčích vzorků musí být přibližně stejná.

Velikost dílčího vzorku v případě objemných krmiv/pícnin s nízkou měrnou hmotností je alespoň 100 gramů, resp. 25 gramů.

V případě, že musí být v souladu s pravidly pro postup odběru vzorků stanovenými v bodě 8 odebráno méně než 40 dílčích vzorků, stanoví se velikost dílčích vzorků podle požadované velikosti souhrnného vzorku (viz bod 6).

V případě odběru vzorků z malých šarží baleného krmiva, kde je podle kvantitativních požadavků třeba odebrat omezený počet dílčích vzorků, se považuje za dílčí vzorek obsah jednoho původního balení, jehož obsah nepřesahuje jeden kg nebo jeden litr.

V případě odběru vzorků z baleného krmiva sestávajícího z malých balení (např. < 250 g) závisí velikost dílčího vzorku na velikosti balení.

V případě vzorků prodeje na dálku závisí velikost dílčího vzorku na velikosti balení a v jednotlivých případech může rovněž obsahovat méně než 100 g nebo 100 ml.

9.2.1.    Volně ložené krmivo

V příslušných případech lze odebrat vzorky v průběhu manipulace se vzorkovanou partií (nakládka či vykládka).

9.2.2.    Balené krmivo

Poté, co byl vybrán požadovaný počet balení k odebrání vzorků, který je stanoven v bodě 5, odebere se část obsahu každého balení pomocí vzorkovače nebo lopatky. V případě potřeby se vzorky odeberou po vyprázdnění každého balení zvlášť.

9.2.3.    Homogenní nebo homogenizovatelná tekutá nebo polotekutá krmiva

Poté, co byl vybrán požadovaný počet balení k odebrání vzorků, jak je uvedeno v bodě 5, jejich obsah se v případě potřeby homogenizuje a z každého balení se odebere určité množství.

Dílčí vzorky mohou být odebrány během stáčení obsahu.

9.2.4.    Nehomogenizovatelná tekutá nebo polotekutá krmiva

Poté, co byl vybrán požadovaný počet balení k odebrání vzorků, který je stanoven v bodě 5, provede se odběr v různých vrstvách.

Vzorky mohou být odebrány rovněž během stáčení obsahu, avšak až po odstranění prvních frakcí.

V obou případech nesmí být celkový objem odebraných vzorků nižší než 10 litrů.

9.2.5.    Krmiva v blocích a minerální lizy

Poté, co byl vybrán požadovaný počet bloků nebo lizů k odebrání vzorků, který je stanoven v bodě 5, z každého bloku nebo lizu se odebere část. V případě podezření na nehomogenní blok nebo liz lze jako vzorek odebrat celý blok nebo liz.

V případě bloků nebo lizů o hmotnosti nejvýše 1 kg se za dílčí vzorek považuje obsah jednoho bloku nebo jednoho lizu.

9.3.    Příprava souhrnných vzorků

Dílčí vzorky se smíchají, aby vznikl jeden souhrnný vzorek.

9.4.    Příprava konečných vzorků

Materiál v souhrnném vzorku se pečlivě promísí ( 5 ).

Každý vzorek se vloží do vhodné nádoby. Učiní se všechna nutná předběžná opatření pro to, aby během přepravy nebo skladování nedošlo ke změně složení vzorku, kontaminaci či narušení.

9.4.1.    Látky rozložené rovnoměrně

V případě kontroly složek nebo látek rozložených v krmivu rovnoměrně lze souhrnný vzorek reprezentativně zredukovat na nejméně 2,0 kg nebo 2,0 litru (redukovaný vzorek) ( 6 ), nejlépe s pomocí mechanického nebo automatického děliče. Pro účely kontroly přítomnosti reziduí pesticidů v luštěninách, zrnech obilovin a ořeších činí minimální velikost redukovaného vzorku 3 kg. Pokud druh krmiva neumožňuje použít dělič nebo pokud dělič není k dispozici, lze vzorek redukovat kvartací.

Konečné vzorky (pro kontrolu, obhajobu a případně srovnání) ze souhrnného vzorku nebo z redukovaných vzorků se poté odeberou v přibližně stejném množství a v souladu s kvantitativními požadavky bodu 7.

9.4.2.    Látky rozložené nerovnoměrně

V případě kontroly složek, včetně geneticky modifikovaného materiálu, nebo látek, které jsou v krmivu pravděpodobně rozloženy nerovnoměrně, musí být souhrnný vzorek:

Konečné vzorky z redukovaného vzorku se poté odeberou v přibližně stejném množství a v souladu s kvantitativními požadavky bodu 7.

9.5.    Balení vzorků

Nádoby nebo balení se zapečetí a opatří štítkem tak, aby je nebylo možno bez poškození pečeti otevřít. Celý štítek musí být součástí pečeti. Vzorek lze rovněž uložit do nádoby, kterou lze uzavřít tak, aby ji nebylo možné bez nevratného poškození nádoby otevřít, což zabrání jejímu opakovaném použití.

9.6.    Zaslání vzorků do laboratoře

Vzorek se společně s údaji nutnými pro osobu provádějící analýzu bez zbytečného prodlení zašle do určené zkušební laboratoře.

10.   PROTOKOL O ODBĚRU VZORKU

O každém vzorku musí být veden protokol, který umožní jednoznačně identifikovat každou vzorkovanou partii a její velikost.

Do protokolu se uvedou veškeré odchylky od postupu odběru vzorků stanoveného v tomto nařízení.

Protokol se kromě úřední kontrolní laboratoře dá k dispozici provozovateli krmivářského podniku a/nebo laboratoři určené provozovatelem krmivářského podniku.

11.   VZOREK PRODEJE NA DÁLKU

---

PŘÍLOHA II

OBECNÁ USTANOVENÍ O METODÁCH ANALÝZY KRMIV

A.   PŘÍPRAVA VZORKŮ PRO ANALÝZU

1.    Účel

Postupy popsané v této příloze se týkají přípravy pro analýzu vzorků, které byly odeslány do kontrolních laboratoří po odběru v souladu s ustanoveními v příloze I.

Laboratorní vzorky musí být připraveny tak, aby byly navážky stanovené v metodách analýzy pro konečné vzorky homogenní a reprezentativní.

Kromě postupů popsaných v této příloze musí být dodrženy pokyny pro přípravu vzorku stanovené v normě EN ISO 6498.

2.    Předběžná opatření

Postup přípravy vzorku, jímž je třeba se řídit, závisí na tom, které metody analýzy se mají použít a které složky nebo látky se mají kontrolovat. Proto je velmi důležité, aby byl příslušný postup přípravy vzorku vhodný pro použitou metodu analýzy a kontrolované složky nebo látky.

Veškeré nezbytné úkony musí být prováděny tak, aby se pokud možno zabránilo kontaminaci vzorku a změnám jeho složení.

Mletí, míchání a prosévání se provádí okamžitě při minimálním vystavení vzorku vlivům vzduchu a světla. Nesmí se používat mlýnky a drtiče, jež by mohly vzorek znatelně zahřát.

V případě krmiv, která jsou obzvláště citlivá na teplo, se doporučuje ruční drcení. Rovněž je třeba zajistit, aby zdrojem kontaminace nebyl samotný přístroj.

Homogenizace vzorku přípravou suspenze smícháním s vodou za vysokých otáček v některých případech prokazatelně poskytuje homogennější podvzorky než suchá homogenizace/mletí, zejména v případě nerovnoměrně rozložených chemických látek. Homogenizace pomocí dostatečného suchého mletí by však také mohla poskytnout homogenní podvzorky.

V některých případech, například pro stanovení obsahu námelu žitného, škodlivých botanických nečistot atd., nelze homogenizaci vzorku provést mletím, ale dostatečným promícháním vzorku.

Pokud nelze přípravu provést bez zásadních změn obsahu vlhkosti ve vzorku, stanoví se obsah vlhkosti před přípravou a po přípravě na základě metody uvedené v části A přílohy III.

3.    Postup

3.1.    Obecný postup

Zkoušená část se odebírá z konečného homogenizovaného vzorku. Dělení vzorku kvartací se nedoporučuje, protože zkoušené části vzniklé tímto dělením mohou být zatíženy velkou chybou.

3.1.1.    Krmiva, která mohou být rozemleta ihned

3.1.2.    Krmiva, která mohou být rozemleta až po usušení

3.1.3.    Tekutá nebo polotekutá krmiva

3.1.4.    Ostatní krmiva

3.2.    Zvláštní postup v případě vizuální prohlídky nebo zkoumání mikroskopem nebo v případě, že je celý souhrnný vzorek homogenizovaný

4.    Skladování vzorků

Vzorky musí být skladovány při takové teplotě, která nezmění jejich složení. Vzorky určené k analýze na obsah vitaminů nebo látek, které jsou obzvláště citlivé na světlo, se skladují tak, aby nedošlo k nepříznivému ovlivnění vzorku působením světla.

B.   USTANOVENÍ O ČINIDLECH A PŘÍSTROJÍCH POUŽÍVANÝCH PŘI METODÁCH ANALÝZY

C.   UPLATŇOVÁNÍ METOD ANALÝZY A VYJADŘOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

1.    Extrakční postup

Některé metody vyžadují zvláštní extrakční postup. Obecně platí, že jiné extrakční postupy, než jsou postupy uvedené v dané metodě, mohou být použity jen pod podmínkou, že se prokáže, že použitý extrakční postup má na zkoušenou matrici rovnocennou extrakční účinnost jako postup uvedený v dané metodě.

2.    Postup čištění

Některé metody vyžadují zvláštní postup čištění. Obecně platí, že jiné postupy čištění, než jsou postupy uvedené v dané metodě, mohou být použity jen pod podmínkou, že se prokáže, že použitý postup čištění vykazuje pro zkoušenou matrici rovnocenné výsledky analýzy jako postup uvedený v dané metodě.

3.    Počet stanovení

Pokud je v případě analýzy na nežádoucí látky výsledek prvního stanovení výrazně (> 50 %) nižší než kontrolovaná specifikace, není zapotřebí žádných dalších stanovení, jestliže byly dodrženy vhodné postupy kontroly kvality. V ostatních případech je zapotřebí opakovaná analýza (druhé stanovení) pro vyloučení možnosti vnitřní křížové kontaminace nebo náhodného pomíchání vzorků. Pro další posouzení se použije střední hodnota těchto dvou stanovení.

Pokud jsou v případě kontroly minimálních nebo maximálních úrovní doplňkových látek výsledky prvního stanovení vyšší než minimální úroveň nebo nižší než maximální úroveň, není zapotřebí žádných dalších stanovení, jestliže byly dodrženy vhodné postupy kontroly kvality. V ostatních případech je zapotřebí opakovaná analýza (druhé stanovení) pro vyloučení možnosti vnitřní křížové kontaminace nebo náhodného pomíchání vzorků. Pro další posouzení se použije střední hodnota těchto dvou stanovení.

Pokud v případě kontroly deklarovaného obsahu látky nebo složky výsledek prvního stanovení potvrdí deklarovaný obsah, tj. jestliže výsledek analýzy spadá do přijatelného rozsahu odchylky od deklarovaného obsahu, není zapotřebí žádných dalších stanovení, jestliže byly dodrženy vhodné postupy kontroly kvality. V ostatních případech je zapotřebí opakovaná analýza (druhé stanovení) pro vyloučení možnosti vnitřní křížové kontaminace nebo náhodného pomíchání vzorků. Pro další posouzení se použije střední hodnota těchto dvou stanovení (průměrný výsledek analýzy spadá, nebo nespadá do přijatelného rozsahu odchylky od deklarovaného obsahu).

V některých případech je tento přijatelný rozsah odchylky vymezen v právních předpisech, např. v nařízení (ES) č. 767/2009 a nařízení Evropského parlamentu a Rady (EU) 2019/4 ( 9 ).

4.    Zpráva o použité metodě analýzy

Použitá metoda analýzy se uvede do protokolu o analýze.

5.    Zpráva o výsledku analýzy

Výsledek analýzy se vyjádří způsobem, který je stanoven v metodě analýzy, příslušným počtem platných číslic a v případě potřeby se koriguje na obsah vlhkosti v konečném vzorku před přípravou.

Většina regulačních limitů (např. maximální úroveň, minimální úroveň) v právních předpisech EU týkajících se krmiv je stanovena ve vztahu ke krmivu o obsahu vlhkosti 12 %. V těchto případech je proto za účelem posouzení výsledku analýzy naměřeného u vzorku vzhledem k regulačnímu limitu třeba výsledek analýzy nejprve vydělit obsahem sušiny ve vzorku (v %) vynásobeným 88, jak je uvedeno v tomto vzorci:

kde:

Mc

:

obsah vlhkosti ve vzorku (v %). 100 – Mc tedy představuje obsah sušiny ve vzorku (v %),

Rana

:

výsledek analýzy naměřený u vzorku,

R12 %

:

výsledek pro krmivo o obsahu vlhkosti 12 %; posoudí se s ohledem na regulační limit.

Dále musí být splněny tyto podmínky:

Je-li výsledek analýzy korigován na obsah vlhkosti, musí být stejným postupem korigována také odpovídající nejistota měření.

V případě stanovení obsahu námelu žitného nebo škodlivých botanických nečistot vizuálním/mikroskopickým zkoumáním není korekce na obsah vlhkosti nutná.

6.    Nejistota měření při analýze a výtěžnost v případě analýzy na nežádoucí látky

Pokud jde o nežádoucí látky ve smyslu směrnice 2002/32/ES, považuje se produkt určený ke krmení za nevyhovující stanovenému maximálnímu obsahu, pokud se na základě výsledku analýzy jakožto střední hodnoty dvou nezávislých stanovení u krmiva o obsahu vlhkosti 12 % pokládá maximální obsah za překročený, přičemž se zohlední rozšířená nejistota měření při analýze a použije se koeficient rozšíření 2, který odpovídá míře spolehlivosti přibližně 95 %, a korekce na výtěžnost. To znamená, že k posouzení souladu se použije analyzovaná koncentrace poté, co byla korigována na výtěžnost, a poté, co byla odečtena rozšířená nejistota měření při analýze. Tento postup se použije pouze v případech, kdy metoda analýzy umožňuje odhad rozšířené nejistoty měření při analýze a korekci na výtěžnost (nevyžaduje se např. v případě vizuálního/mikroskopického zkoumání).

Pokud výsledek analýzy vzorku odebraného pro účely obhajoby překročí maximální obsah (bez zohlednění rozšířené nejistoty měření při analýze), potvrzuje to nesoulad s kontrolním vzorkem, pokud v tomto ohledu neexistují zvláštní vnitrostátní předpisy.

Výsledek analýzy (pokud použitá metoda analýzy umožňuje odhad rozšířené nejistoty měření při analýze) se oznámí v této podobě:

Pokud je však výsledek analýzy výrazně (> 50 %) nižší než kontrolovaná specifikace, a jestliže byly dodrženy vhodné postupy kontroly kvality a analýza slouží jen pro účely kontroly souladu s právními předpisy, lze zprávu o výtěžnosti a o rozšířené nejistotě měření při analýze vynechat (např. v případech, kdy neexistuje žádná specifikace nebo regulační limit), není-li nejistota měření nezbytná pro interpretaci.

7.    Nejistota měření při analýze a výtěžnost v případě analýzy obsahu doplňkových látek

Za účelem kontroly dodržování povoleného minimálního a maximálního obsahu doplňkových látek se přítomnost doplňkové látky považuje za nevyhovující stanovenému minimálnímu a maximálnímu obsahu, pokud se na základě výsledku analýzy jakožto střední hodnoty dvou nezávislých stanovení u krmiva o obsahu vlhkosti 12 % pokládá:

Pokud výsledek analýzy vzorku odebraného pro účely obhajoby překročí maximální obsah (bez zohlednění rozšířené nejistoty měření při analýze), potvrzuje to nesoulad s kontrolním vzorkem, pokud v tomto ohledu neexistují zvláštní vnitrostátní předpisy.

Výsledek analýzy (pokud použitá metoda analýzy umožňuje odhad rozšířené nejistoty měření při analýze) se oznámí v této podobě:

---

PŘÍLOHA III

METODY ANALÝZY PRO KONTROLU SLOŽENÍ KRMNÝCH SUROVIN A KRMNÝCH SMĚSÍ

A.   STANOVENÍ OBSAHU VLHKOSTI

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu vlhkosti v krmivech. V případě, že krmivo obsahuje těkavé látky, např. organické kyseliny, je třeba zohlednit, že spolu s obsahem vlhkosti se stanoví i značné množství těkavých látek.

Tato metoda se nevztahuje na analýzu mléčných výrobků jako krmných surovin a krmných směsí, které jsou tvořeny převážně mléčnými výrobky, analýzu živočišných a rostlinných tuků a olejů ani na analýzu olejnatých semen a plodů.

Stanovení obsahu vlhkosti v olejnatých semenech se stanoví metodou uvedenou v normě EN ISO 665 (Stanovení vlhkosti a obsahu těkavých látek) s tím, že sójové boby musí být před stanovením obsahu vlhkosti rozemlety.

2.    Princip

Vzorek se suší za předepsaných podmínek, které závisejí na druhu krmiva. Úbytek hmotnosti se stanoví vážením. U pevných krmiv s vysokým obsahem vlhkosti je nutné provést předsoušení.

3.    Přístroje

4.    Postup

4.1.    Příprava

4.1.1.    Krmiva jiná než krmiva uvedená v bodech 4.1.2 a 4.1.3

Odebere se minimálně 50 g vzorku. Pokud je to nutné, vzorek se rozdrtí nebo rozmělní takovým způsobem, aby nedošlo ke změně obsahu vlhkosti (viz bod 6).

4.1.2.    Obiloviny a kroupy

Odebere se minimálně 50 g vzorku. Toto množství se rozemele tak, aby alespoň 50 % částic prošlo sítem s oky o velikosti 0,5 mm a zbytek na sítě s kulatými oky o velikosti 1 mm činil maximálně 10 %.

4.1.3.    Tekutá nebo pastovitá krmiva a krmiva, která jsou složena převážně z olejů a tuků

Odebere se přibližně 25 g vzorku s přesností na 10 mg, smíchá se s odpovídajícím množstvím předem vysušeného písku zváženého s přesností na 10 mg, až vznikne homogenní hmota.

4.2.    Sušení

Vysoušečka (bod 3.3) s víčkem se suší v sušárně nastavené na 103 °C po dobu 30 minut ± 1 min. Ze sušárny se poté vytáhne a nechá se vychladnout na teplotu okolí v exsikátoru (bod 3.6).

4.2.1.    Krmiva jiná než krmiva uvedená v bodech 4.2.2 a 4.2.3

Vysoušečka s víčkem se zváží s přesností na 1 mg. Do předem zvážené vysoušečky se naváží přibližně 5 g vzorku s přesností na 1 mg a rovnoměrně se rozprostře. Vysoušečka se po sejmutí víčka umístí do sušárny předehřáté na 103 °C. Aby se zabránilo nežádoucímu poklesu teploty, je třeba vložit vysoušečku do sušárny co nejrychleji. Sušení probíhá čtyři hodiny, přičemž doba sušení se počítá od okamžiku, kdy teplota v sušárně opět dosáhla 103 °C. Po otevření vakuové laboratorní sušárny se vysoušečka ihned opět uzavře víčkem, vyjme ze sušárny, nechá vychladnout 30–45 minut v exsikátoru (bod 3.6) a nakonec se zváží s přesností na 1 mg.

U krmiv, která se převážně (> 50 %) skládají z olejů a tuků živočišného a rostlinného původu, se suší v sušárně ještě dalších 30 minut při teplotě 103 °C. Rozdíl mezi těmito dvěma váženími nesmí být větší než 0,1 % vlhkosti.

4.2.2.    Obiloviny, mouka, kroupy a krupice

Vysoušečka s víčkem se zváží s přesností na 0,5 mg. Do předem zvážené vysoušečky se naváží přibližně 5 g rozdrceného vzorku s přesností na 1 mg a rovnoměrně se rozprostře. Vysoušečka se po sejmutí víčka umístí do sušárny předehřáté na 130 °C. Aby se zabránilo nežádoucímu poklesu teploty, je třeba vložit vysoušečku do sušárny co nejrychleji. Sušení probíhá dvě hodiny, přičemž doba sušení se počítá od okamžiku, kdy teplota v sušárně opět dosáhla 130 °C. Po otevření vakuové laboratorní sušárny se vysoušečka ihned opět uzavře víčkem, vyjme ze sušárny, nechá vychladnout 30–45 minut v exsikátoru (bod 3.6) a nakonec se zváží s přesností na 1 mg.

4.2.3.    Krmné směsi obsahující více než 4 % sacharózy nebo laktózy: krmné suroviny jako svatojánský chléb, hydrolyzované produkty z obilovin, sladový květ, sušené cukrovarnické řízky, rybí a cukerný vývar

Vysoušečka s víčkem se zváží s přesností na 0,5 mg. Do předem zvážené vysoušečky se naváží přibližně 5 g vzorku s přesností na 1 mg a rovnoměrně se rozprostře. Vysoušečka se po sejmutí víčka umístí do vakuové sušárny (bod 3.5) předehřáté na 80–85 °C. Aby se zabránilo nežádoucímu poklesu teploty, je třeba vložit vysoušečku do sušárny co nejrychleji.

Tlak se upraví na 100 torrů a vzorek se suší při tomto tlaku čtyři hodiny buď pomocí přívodu horkého a suchého vzduchu, nebo pomocí vysoušecího prostředku (přibližně 300 g na 20 vzorků). V tomto druhém případě se přeruší spojení s vakuovou pumpou, jakmile bylo dosaženo předepsaného tlaku. Doba sušení se počítá od okamžiku, kdy bylo v sušárně opět dosaženo teploty 80–85 °C. Potom se tlak v sušárně opatrně upraví zpět na atmosférický tlak. Po otevření vakuové laboratorní sušárny se vysoušečka ihned opět uzavře víčkem, vyjme ze sušárny, nechá vychladnout 30–45 minut v exsikátoru (bod 3.6) a nakonec se zváží s přesností na 1 mg. Vysoušečka se suší dalších 30 minut ve vakuové sušárně při teplotě 80–85 °C a znovu se zváží. Rozdíl mezi těmito dvěma váženími nesmí být větší než 0,1 % vlhkosti.

4.3.    Předsoušení (částečné sušení)

Před jemným mletím je nezbytné „vlhká“ krmiva s hmotnostním podílem nižším než 85 % sušiny (např. pícniny, směsné krmné dávky, (ne)tekutá krmiva) částečně vysušit, aby bylo možné analyzovat jejich stabilní látky; u nestabilních látek není částečné sušení možné.

Částečné sušení lze provést buď za použití sušárny s nucenou cirkulací vzduchu či mikrovlnné sušárny, nebo mrazovým sušením. S výjimkou částečného sušení mrazovým sušením je cílem vysušit krmivo při zachování teploty vzorku pod 60 °C, aby bylo chemické složení co nejméně ovlivněno. Sušení při teplotách vyšších než 60 °C způsobuje chemické změny v krmivu (např. rozklad bílkovin). Vysušené krmivo se před měřením částečného obsahu sušiny nechá ekvilibrovat při laboratorní teplotě po dobu přibližně 15 minut, aby se minimalizovala potenciální změna vlhkosti, k níž může dojít při mletí a skladování. Sušením při teplotách nižších než 60 °C se z krmiva neodstraní veškerá voda; (počáteční) částečné sušení proto nepředstavuje celkovou sušinu daného krmiva. Po sušení se podvzorek rozemele a analyzuje se na (konečnou) sušinu částečně sušeného vzorku (zbývající 3 % až 15 % vlhkosti), pokud se stanovují jiné chemické složky.

Proto se pro stanovení obsahu sušiny doporučuje dvoufázový postup. Nejprve se stanoví částečný obsah sušiny (pokud se jedná o méně než 85 % sušiny), poté se stanoví obsah zbývající sušiny na rozemletém zkušebním vzorku a částečný obsah sušiny se vynásobí obsahem zbývající sušiny, aby se stanovil celkový obsah sušiny.

5.    Výpočet výsledků

Obsah vlhkosti (X) jako procento vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

5.1.    Sušení bez předsoušení

kde:

m

=

počáteční hmotnost zkušebního vzorku v gramech,

m0

=

hmotnost sušeného zkušebního vzorku v gramech.

5.2.    Sušení s předsoušením ( 13 )

kde:

m

=

počáteční hmotnost zkušebního vzorku v gramech,

m1

=

hmotnost zkušebního vzorku po předsoušení v gramech,

m2

=

hmotnost zkušebního vzorku po rozdrcení nebo rozemletí v gramech,

m0

=

hmotnost sušeného zkušebního vzorku v gramech.

5.3.    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit 0,2 % absolutní hodnoty vlhkosti, s výjimkou vlhkého krmiva pro zvířata v zájmovém chovu a žvýkacích pamlsků pro psy, kde rozdíl nesmí překročit 0,5 % absolutní hodnoty vlhkosti.

6.    Poznámka

Pokud je nutné vzorek rozdrtit a pokud se na základě toho musí počítat se změnou obsahu vlhkosti produktu, je nutno korigovat výsledky analýzy jednotlivých složek krmiva podle obsahu vlhkosti vzorku v jeho původním stavu.

B.   STANOVENÍ OBSAHU VLHKOSTI V ŽIVOČIŠNÝCH A ROSTLINNÝCH TUCÍCH A OLEJÍCH

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu vody a těkavých látek v živočišných a rostlinných tucích a olejích.

2.    Princip

Vzorek se vysuší do konstantní hmotnosti při 103 °C (úbytek hmotnosti mezi dvěma po sobě následujícími váženími musí být maximálně 1 mg). Úbytek hmotnosti se stanoví vážením.

3.    Přístroje

4.    Postup

Do misky (bod 3.1), předem vysušené a zvážené, opatřené teploměrem (bod 3.2) se naváží přibližně 20 g homogenizovaného vzorku s přesností na 1 mg. Zahřívá se na pískové lázni nebo na topné desce (bod 3.3) za stálého promíchávání teploměrem tak, aby teplota během asi 7 minut dosáhla 90 °C.

Zahřívání se sníží a sleduje se intenzita tvorby bublin, které stoupají ode dna misky. Teplota nesmí přesáhnout 105 °C. V důkladném míchání ode dna misky se pokračuje, dokud se nepřestanou tvořit bubliny.

Během zahřívání se vzorek několikrát zahřeje na 103 ± 2 °C a ochladí na 93 °C, aby se zajistilo úplné odstranění vlhkosti. Poté se nechá vychladnout na laboratorní teplotu v exsikátoru (bod 3.4) a zváží se. Tento postup se opakuje, dokud není dosaženo úbytku hmotnosti mezi dvěma po sobě následujícími váženími nepřesahujícího 2 mg.

5.    Výpočet výsledků

Obsah vlhkosti (X) jako procento vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

m

=

hmotnost zkušebního vzorku v gramech,

m1

=

hmotnost misky s obsahem před ohřevem v gramech,

m2

=

hmotnost misky s obsahem po ohřevu v gramech.

Výsledky nižší než 0,05 % musí být uváděny jako „nižší než 0,05 %“.

Opakovatelnost

Rozdíl ve vlhkosti mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit 0,1 % v absolutní hodnotě.

C.   STANOVENÍ OBSAHU DUSÍKU A VÝPOČET OBSAHU HRUBÉHO PROTEINU

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu hrubého proteinu v krmivech na základě stanovení obsahu dusíku podle Kjeldahlovy metody ( 14 ).

2.    Princip

Vzorek se mineralizuje kyselinou sírovou za přítomnosti katalyzátoru. Kyselý roztok se alkalizuje roztokem hydroxidu sodného. Amoniak se vydestiluje a jímá se do odměřeného množství kyseliny sírové a přebytek se titruje standardním roztokem hydroxidu sodného.

Uvolněný amoniak se případně vydestiluje do přebytku roztoku kyseliny borité a následně se titruje roztokem kyseliny chlorovodíkové nebo kyseliny sírové.

3.    Činidla

Pokud se použije kolorimetrická detekce koncového bodu, do roztoků kyseliny borité se musí přidat indikátory methylčerveň a bromokresol. Pokud se připravuje 1 litr roztoku kyseliny borité, před úpravou objemu se přidá 7 ml i indikátorového roztoku methylčerveně (bod 3.16) a 10 ml roztoku bromokresolové zeleně (bod 3.17).

V závislosti na použité vodě se může pH jednotlivých roztoků kyseliny borité u různých šarží lišit. pH roztoku kyseliny borité musí být mezi 4,3 a 4,7. Často je nezbytná úprava pomocí malého množství zásadité látky, aby se získal pozitivní slepý vzorek.

4.    Přístroje

Přístroje vhodné pro provedení mineralizace, destilace a titrace podle Kjeldahlovy metody.

5.    Postup

5.1.    Mineralizace

Do mineralizační baňky se naváží 1 g vzorku s přesností na 0,001 g. Přidá se 15 g síranu draselného (bod 3.1) a vhodné množství katalyzátoru (bod 3.2) (0,3–0,4 g oxidu měďnatého nebo 0,9–1,2 g síranu měďnatého, pentahydrátu, 25 ml kyseliny sírové (bod 3.4) a, pokud je třeba, několik granulí pemzy (bod 3.12) a zamíchá se.

Baňka se zahřívá nejprve mírně a podle potřeby se občas zamíchá, dokud nedojde ke zuhelnatění hmoty a neustane pěnění; potom se intenzita zahřívání zvyšuje, dokud se kapalina ustáleně nevaří. Zahřívání je odpovídající, pokud vroucí kyselina kondenzuje na stěnách baňky. Nesmí docházet k přehřívání stěn baňky a k ulpívání organických částic na stěnách baňky.

Jakmile se roztok stane čirým a získá světle zelené zabarvení, pokračuje se v ohřevu ještě dvě hodiny a potom se ponechá vychladnout.

5.2.    Destilace

Opatrně se přidá tolik vody, aby došlo k úplnému rozpuštění sulfátů. Nechá se vychladnout a potom se přidá několik granulí zinku (bod 3.3), pokud je třeba. Dále se postupuje podle bodu 5.2.1 nebo 5.2.2.

5.2.1.    Destilace do kyseliny sírové

Do předlohy destilačního zařízení se odměří přesně 25 ml kyseliny sírové (bod 3.5) nebo (bod 3.7) podle předpokládaného obsahu dusíku. Přidá se několik kapek indikátoru methylčerveň (bod 3.8).

Mineralizační baňka se připojí ke kondenzátoru destilačního přístroje a konec kondenzátoru se ponoří do kapaliny v předloze do hloubky nejméně 1 cm (viz poznámka v bodě 8.3). Do mineralizační baňky se zvolna přilije 100 ml roztoku hydroxidu sodného (bod 3.9) tak, aby nedošlo ke ztrátám amoniaku (viz poznámka v bodě 8.1). Baňka se zahřívá, dokud se nepředestiluje veškerý amoniak.

5.2.2.    Destilace do kyseliny borité

V případě manuální titrace amoniakového obsahu destilátu se použije níže popsaný postup. Pokud je destilační jednotka plně automatická a zahrnuje titraci amoniakového obsahu destilátu, dodrží se pokyny výrobce pro provoz destilační jednotky.

Předloha s obsahem 25–30 ml roztoku kyseliny borité (bod 3.18) se umístí pod otvor kondenzátoru tak, že jeho vývod je ponořen pod hladinu přebytku roztoku kyseliny borité. Destilační jednotka se upraví na dávkování 50 ml roztoku hydroxidu sodného (bod 3.9). S destilační jednotkou se pracuje podle pokynů výrobce a oddestiluje se amoniak uvolněný přidáním roztoku hydroxidu sodného. Destilát se jímá do roztoku kyseliny borité. Množství destilátu (doba destilace párou) závisí na množství dusíku ve vzorku. Je třeba dodržet pokyny výrobce.

5.3.    Titrace

Dále se postupuje podle bodu 5.3.1 nebo 5.3.2.

5.3.1.    Kyselina sírová

Přebytek kyseliny sírové v předloze se titruje roztokem hydroxidu sodného (bod 3.10 nebo 3.11) podle použité koncentrace kyseliny sírové do dosažení koncového bodu.

5.3.2.    Kyselina boritá

Obsah předlohy se titruje se standardním odměrným roztokem kyseliny chlorovodíkové (bod 3.19) nebo se standardním odměrným roztokem kyseliny sírové (bod 3.6) s použitím byrety a odečte se množství použitého titračního činidla.

Pokud se použije kolorimetrická detekce koncového bodu, je koncového bodu dosaženo při prvním zbarvení obsahu do růžova. Odečte se objem byretou s přesností na 0,05 ml. Koncový bod může být zřetelnější při použití osvětlené desky magnetické míchačky nebo fotometrického detektoru.

Lze provést automaticky s použitím parního destilátoru s automatickou titrací.

Je třeba dodržet pokyny výrobce pro provoz konkrétního destilačního přístroje nebo destilačního/titračního přístroje.

Při použití plně automatické destilační jednotky lze automatickou titraci amoniaku provést rovněž pomocí detekce koncového bodu s použitím potenciometrického systému pH.

V tomto případě se použije automatický titrační přístroj s pH metrem. pH metr je správně kalibrován v rozsahu pH 4–7 podle běžných laboratorních postupů pro kalibraci pH.

Takto bude pH koncového bodu titrace dosaženo při hodnotě pH 4,6, přičemž se jedná o nejstrmější skok na titrační křivce (inflexní bod).

5.4.    Slepá zkouška

Pro potvrzení, že všechna použitá činidla jsou prostá dusíku, se provede slepá zkouška (mineralizace, destilace a titrace) s 1 g sacharózy (bod 3.14) místo vzorku.

6.    Výpočet výsledků

Výpočet se provede podle bodu 6.1 nebo 6.2.

6.1.    Výpočet pro titraci podle bodu 5.3.1

Obsah hrubého proteinu vyjádřený v procentech hmotnosti se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

V0

=

spotřeba NaOH (bod 3.10 nebo 3.11) na slepou zkoušku v ml,

V1

=

spotřeba NaOH (bod 3.10 nebo 3.11) na titraci vzorku v ml,

c

=

koncentrace hydroxidu sodného (bod 3.10 nebo 3.11) v mol/l,

m

=

hmotnost vzorku v g.

6.2.    Výpočet pro titraci podle bodu 5.3.2

6.2.1.    Titrace kyselinou chlorovodíkovou

Obsah hrubého proteinu vyjádřený v procentech hmotnosti se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

m

=

hmotnost navážky vzorku v g,

c

=

koncentrace standardního odměrného roztoku hydroxidu sodného (bod 3.19) v mol/l,

V0

=

spotřeba kyseliny chlorovodíkové na slepou zkoušku v ml,

V1

=

spotřeba kyseliny chlorovodíkové na navážku vzorku v ml.

6.2.2.    Titrace kyselinou sírovou

Obsah hrubého proteinu vyjádřený v procentech hmotnosti se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

m

=

hmotnost navážky vzorku v g,

c

=

koncentrace standardního odměrného roztoku kyseliny sírové (bod 3.6) v mol/l,

V0

=

spotřeba kyseliny sírové (bod 3.6) na slepou zkoušku v ml,

V1

=

spotřeba kyseliny sírové (bod 3.6) na navážku vzorku v ml.

7.    Verifikace metody

7.1.    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit:

7.2.    Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených u téhož vzorku v různých laboratořích nesmí překročit:

7.3.    Přesnost

Provede se analýza (mineralizace, destilace a titrace) vhodného množství acetanilidu (bod 3.13) (např. 0,2 až 0,3 g) za přítomnosti 1 g sacharózy (bod 3.14); spotřeba kyseliny sírové (bod 3.5) na 1 g acetanilidu je 14,80 ml. Výtěžnost musí být nejméně 99 %.

8.    Poznámky

D.   STANOVENÍ OBSAHU MOČOVINY

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu močoviny použité jako doplňková látka v krmivech pro přežvýkavce.

2.    Princip

Vzorek s čeřicím činidlem se rozmíchá ve vodě. Suspenze se přefiltruje. Obsah močoviny ve filtrátu se stanoví po přidání 4-dimethylaminobenzaldehydu (4-DMAB) měřením optické hustoty při vlnové délce 420 nm.

3.    Činidla

4.    Přístroje

5.    Postup

5.1.    Analýza vzorku

Do 500 ml odměrné baňky se naváží 2 g vzorku s přesností na 1 mg a přidá se 1 g aktivního uhlí (bod 3.4). Přidá se 400 ml vody a 5 ml Carrezova činidla I (bod 3.2), míchá se po dobu přibližně 30 sekund a přidá se 5 ml Carrezova činidla II (bod 3.3). Míchá se po dobu 30 minut na míchacím zařízení. Doplní se vodou po značku, protřepe se a přefiltruje.

Do zkumavek se skleněnými zábrusovými zátkami se odpipetuje 5 ml čirého, bezbarvého filtrátu, přidá se 5 ml roztoku 4-DMAB (bod 3.1) a promíchá. Zkumavky se vloží do vodní lázně nastavené na teplotu 20 °C (± 4 °C). Po patnácti minutách se změří optická hustota roztoku vzorku na spektrofotometru při vlnové délce 420 nm. Porovná se slepou zkouškou roztoku činidel.

5.2.    Kalibrační křivka

Do odměrných baněk na 100 ml se napipetuje 1, 2, 4, 5 a 10 ml roztoku močoviny (bod 3.5) a doplní se po značku vodou. Z těchto roztoků se odpipetuje 5 ml, ke každému se přidá 5 ml roztoku 4-DMAB (bod 3.1), homogenizuje se a změří se optická hustota, jak je uvedeno výše, a porovná s kontrolním roztokem obsahujícím 5 ml 4-DMAB a 5 ml vody bez močoviny. Sestaví se kalibrační křivka.

6.    Výpočet výsledků

Stanoví se množství močoviny ve vzorku s použitím kalibrační křivky.

Výsledek se vyjádří v mg močoviny na kg vzorku.

7.    Evaluace metody

7.1.    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených u téhož vzorku v téže laboratoři a týmž laborantem nesmí překročit:

7.2.    Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených u téhož vzorku v různých laboratořích a/nebo různými laboranty nesmí překročit:

8.    Výsledky kolaborativní studie

V EU bylo provedeno mezilaboratorní srovnání, jehož se zúčastnilo 18 laboratoří. Pět pozitivních vzorků krmných směsí pro přežvýkavce (v tabulkách 1 a 2 označených jako MAT) bylo analyzováno (jedna analýza) v slepých duplikátech a jeden slepý vzorek krmné směsi pro přežvýkavce byl analyzován jednou.

Výpočty mezních hodnot opakovatelnosti (r) a reprodukovatelnosti (R), jak jsou vymezeny v mezinárodních pokynech, byly provedeny po vyloučení odlehlých hodnot pomocí analýzy rozptylu platných hodnot.

Vypočtené hodnoty účinnosti metody (opakovatelnost, reprodukovatelnost) jsou uvedeny v tabulkách níže. U všech zkušebních vzorků včetně slepého vzorku nebyly zjištěny žádné falešně pozitivní ani falešně negativní výsledky.

9.    Poznámky

E.   STANOVENÍ OBSAHU AMINOKYSELIN (KROMĚ TRYPTOFANU)

Metody analýzy, které se mají použít pro stanovení obsahu aminokyselin (kromě tryptofanu), jsou:

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu volných (syntetických a přírodních) a celkových (na peptidy vázaných a volných) aminokyselin v krmných surovinách, krmných směsích a premixech obsahujících méně než 10 % ( 16 ) každé aminokyseliny za použití analyzátoru aminokyselin. Metoda je použitelná pro tyto aminokyseliny: cyst(e)in, methionin, lysin, threonin, alanin, arginin, kyselinu asparagovou, kyselinu glutamovou, glycin, histidin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, serin, tyrosin a valin.

Tato metoda nerozlišuje mezi jednotlivými solemi aminokyselin a neumožňuje také u aminokyselin rozlišovat mezi formami D a L. Není použitelná pro stanovení tryptofanu nebo hydroxyanalogů aminokyselin.

2.    Princip

2.1.    Volné aminokyseliny

Volné aminokyseliny se extrahují zředěnou kyselinou chlorovodíkovou. Současně extrahované dusíkaté makromolekuly se vysráží kyselinou sulfosalicylovou a odstraní se filtrací. Přefiltrovaný roztok se upraví na pH 2,20. Aminokyseliny se separují ionexovou chromatografií a stanoví se po reakci s ninhydrinem fotometrickou detekcí při 570 nm.

2.2.    Celkové aminokyseliny

Zvolený postup závisí na zkoumaných aminokyselinách. Cyst(e)in a methionin musí být před hydrolýzou oxidovány na kyselinu cysteovou a na methioninsulfon. Tyrosin se musí stanovovat v hydrolyzátech neoxidovaných vzorků. Všechny ostatní aminokyseliny uvedené v bodě 1 (Účel a oblast použití) mohou být stanovovány buď v oxidovaném, nebo v neoxidovaném vzorku.

Oxidace se provádí při 0 °C směsí kyseliny permravenčí a fenolu. Nadbytečné oxidační činidlo se rozloží disiřičitanem sodným. Oxidovaný nebo neoxidovaný vzorek se hydrolyzuje kyselinou chlorovodíkovou (bod 3.20) po 23 hodin. Hydrolyzát se upraví na pH 2,20. Aminokyseliny se separují ionexovou chromatografií a stanovují se po reakci s ninhydrinem fotometrickou detekcí při 570 nm (440 nm pro prolin).

3.    Činidla

Musí být použita dvakrát destilovaná voda nebo voda obdobné jakosti (vodivost < 10 μS).

300 g NaOH (bod 3.5) se rozpustí ve vodě a doplní na 1 litr.

40 g NaOH (bod 3.5) se rozpustí ve vodě a doplní na 1 litr.

smíchá se 889 g kyseliny mravenčí (bod 3.2) se 111 g vody a přidá se 4,73 g fenolu (bod 3.3).

do 492 ml HCl (bod 3.7) se přidá 1 g fenolu (bod 3.3) a doplní se vodou na 1 litr.

60 g kyseliny 5-sulfosalicylové (bod 3.6) se rozpustí ve vodě a doplní se vodou na 1 litr.

v malé kádince se smíchá 0,5 ml peroxidu vodíku (bod 3.1) s 4,5 ml roztoku kyseliny mravenčí a fenolu (bod 3.19). Ponechá se v klidu jednu hodinu při 20–30 °C, aby se utvořila kyselina permravenčí, před přidáním ke vzorku se směs ochladí v lázni s ledovou vodou (15 minut).

Upozornění: je nutno zamezit kontaktu s kůží a používat ochranný oděv.

v přibližně 800 ml vody se rozpustí 19,61 g citronanu sodného (bod 3.8), 5 ml thiodiglykolu (bod 3.9), 1 g fenolu (bod 3.3) a 16,50 ml HCl (bod 3.7). pH se upraví na 2,20. Doplní se vodou na 1 litr.

c = 2,5 μmol/ml pro každou aminokyselinu v kyselině chlorovodíkové.

Tento roztok lze obdržet i komerčně připravený.

Do odměrné baňky o objemu 1 litr se naváží 0,2115 g kyseliny cysteové (bod 3.16.2) a 0,2265 g methioninsulfonu (bod 3.16.3), rozpustí se v citrátovém tlumivém roztoku (bod 3.24) a doplní se jím po značku. Skladuje se při teplotě pod 5 °C nejdéle 12 měsíců. Tento roztok se nepoužívá, pokud zásobní standardní roztok (bod 3.27.1) obsahuje kyselinu cysteovou a methioninsulfon.

Do 250 ml odměrné baňky se naváží 0,6560 g norleucinu (bod 3.13), rozpustí se v citrátovém tlumivém roztoku (bod 3.24) a doplní se jím po značku. Skladuje se při teplotě pod 5 °C nejdéle 6 měsíců.

Roztok se kvantitativně převede do 50 ml odměrné baňky, doplní se po značku citrátovým tlumivým roztokem (bod 3.24) a zamíchá.

Skladuje se při teplotě pod 5 °C nejdéle 3 měsíce.

Viz také poznámka v bodě 9.1.

Skladuje se při teplotě pod 5 °C nejdéle 3 měsíce.

4.    Přístroje

Kolona se naplní sulfonovanou polystyrenovou pryskyřicí, která je schopna separovat jednotlivé aminokyseliny od sebe navzájem i od ostatních ninhydrin-pozitivních materiálů. Průtok tlumivého roztoku a ninhydrinu zajišťují čerpadla se stálostí průtoku ± 0,5 % po dobu zahrnující standardní kalibraci i analýzu vzorku.

U některých analyzátorů aminokyselin je možné použít postupy hydrolýzy, při nichž hydrolyzát vykazuje koncentraci sodíku c = 0,8 mol/l a obsahuje veškerou zbytkovou kyselinu mravenčí z oxidačního kroku. Jiné analyzátory nezaručují uspokojivou separaci určitých aminokyselin, obsahuje-li hydrolyzát nadbytečnou kyselinu mravenčí a/nebo vysoké koncentrace sodíkových iontů. V takovém případě se sníží objem kyseliny před úpravou pH odpařením hydrolyzátu na objem přibližně 5 ml. Odpaření se provádí ve vakuu při teplotě nejvýše 40 °C.

5.    Postup

5.1.    Příprava vzorku

Vzorek se rozemele tak, aby prošel sítem s oky o velikosti 0,5 mm. Vzorky s vysokou vlhkostí se musí před mletím vysušit buď na vzduchu při teplotě nepřesahující 50 °C, nebo mrazovým sušením. Vzorky s vysokým obsahem tuku se před mletím extrahují petroletherem (bod 3.12).

5.2.    Stanovení volných aminokyselin

Do kónické baňky se naváží příslušné množství (1–5 g) připraveného vzorku (bod 5.1) s přesností na 0,2 mg a přidá se 100,0 ml extrakční směsi (bod 3.21). Směs se třepe 60 minut na mechanické třepačce nebo magnetické míchačce (bod 4.8). Po usazení sedimentu se odpipetuje 10,0 ml supernatantu do 100 ml kádinky.

Za stálého míchání se přidá 5,0 ml roztoku kyseliny sulfosalicylové (bod 3.22) a pokračuje se v míchání na magnetické míchačce dalších 5 minut. Supernatant se přefiltruje nebo odstředí tak, aby se odstranila veškerá sraženina. 10,0 ml výsledného roztoku se přenese do 100 ml kádinky, pH se upraví na 2,20 roztokem hydroxidu sodného (bod 3.18), potom se roztok převede pomocí citrátového tlumivého roztoku (bod 3.24) do odměrné baňky přiměřené velikosti a doplní po značku tlumivým roztokem (bod 3.24).

Použije-li se vnitřní standard, přidá se 1,00 ml vnitřního standardu (bod 3.27.3) na každých 100 ml konečného roztoku a potom se doplní po značku tlumivým roztokem (bod 3.24).

Dále se postupuje podle bodu 5.4 – chromatografie.

Nejsou-li extrakty zkoušeny týž den, uchovávají se při teplotě pod 5 °C.

5.3.    Stanovení celkových aminokyselin

5.3.1.    Oxidace

0,1–1 g připraveného vzorku (bod 5.1) se odváží s přesností na 0,2 mg:

Navážka vzorku musí mít obsah dusíku přibližně 10 mg a obsah vlhkosti nepřesahující 100 mg.

Baňka/nádoba se umístí do lázně s ledovou vodou a ochladí se na teplotu 0 °C, potom se přidá 5 ml oxidační směsi (bod 3.23) a promíchá se skleněnou lžící se zahnutou špičkou. Baňka/nádoba se uzavře i se lžící vzduchotěsnou fólií a vloží se v s lázni s ledovou vodou do chladničky a ponechá se v ní 16 hodin při teplotě 0 °C. Po 16 hodinách se vyjme z chladničky a přebytečné oxidační činidlo se rozloží přidáním 0,84 g disiřičitanu sodného (bod 3.4).

Dále se postupuje podle bodu 5.3.2.1.

5.3.2.    Hydrolýza

K oxidovanému vzorku připravenému podle bodu 5.3.1 se přidá 25 ml hydrolyzační směsi (bod 3.20), přičemž veškeré zbytky vzorku ulpělé na stěnách nádoby a na lžíci se musí opláchnout.

Podle zvoleného postupu hydrolýzy se pokračuje podle bodu 5.3.2.3 nebo 5.3.2.4.

Do 100 ml nebo 250 ml baňky s kulatým dnem (bod 4.1) nebo do 100 ml nádoby se šroubovacím uzávěrem (bod 4.2) se naváží 0,1–1 g připraveného vzorku (bod 5.1) s přesností na 0,2 mg. Navážka vzorku musí mít obsah dusíku přibližně10 mg. Opatrně se přidá 25 ml hydrolyzační směsi (bod 3.20) a smíchá se vzorkem. Dále se postupuje podle bodu 5.3.2.3 nebo 5.3.2.4.

Ke směsi v baňce (připravené podle bodu 5.3.2.1 nebo 5.3.2.2) se přidají 3 skleněné kuličky a směs se uvede do mírného varu pod zpětným chladičem na dobu 23 hodin. Po skončení hydrolýzy se zpětný chladič promyje 5 ml citrátového tlumivého roztoku (bod 3.24). Baňka se odpojí a ochladí se v ledové lázni.

Dále se postupuje podle bodu 5.3.3.

Nádoba se směsí připravenou podle bodu 5.3.2.1 nebo 5.3.2.2 se umístí do sušárny (bod 4.3) při 110 °C. Aby se během první hodiny zabránilo narůstání tlaku (v důsledku vzniku plynných látek) a aby nedošlo k výbuchu, položí se šroubovací uzávěr volně na nádobu. Nádoba se neuzavírá. Po uplynutí jedné hodiny se uzávěr zašroubuje a uzavřená nádoba se ponechá v sušárně (bod 4.3) 23 hodin. Po skončení hydrolýzy se nádoba vyjme ze sušárny, opatrně se odšroubuje uzávěr a nádoba se postaví do lázně s ledovou vodou. Nechá se vychladnout.

Podle zvoleného postupu pro úpravu pH (bod 5.3.3) se obsah nádoby kvantitativně převede pomocí citrátového tlumivého roztoku (bod 3.24) do 250 ml kádinky nebo do 250 ml baňky s kulatým dnem.

Dále se postupuje podle bodu 5.3.3.

5.3.3.    Úprava pH

Podle toho, jakou toleranci k sodíku má analyzátor aminokyselin (bod 4.9), postupuje se při úpravě pH podle bodu 5.3.3.1, nebo 5.3.3.2.

Pokud použitý analyzátor aminokyselin vyžaduje nízkou koncentraci sodíku (má-li se obsah kyselin snížit), doporučuje se použít zásobní roztok vnitřního standardu (bod 3.27.3).

V takovém případě se před odpařováním přidají do hydrolyzátu 2,00 ml zásobního roztoku vnitřního standardu (bod 3.27.3).

Do hydrolyzátu připraveného podle bodu 5.3.2.3 nebo 5.3.2.4 se přidají 2 kapky 1-oktanolu (bod 3.15).

Na rotační odparce (bod 4.7) se sníží objem na 5–10 ml za vakua při 40 °C. Pokud by se objem nedopatřením snížil pod 5 ml, hydrolyzát je třeba odstranit a analýzu zahájit znovu.

pH se upraví na 2,20 roztokem hydroxidu sodného (bod 3.18) a dále se postupuje podle bodu 5.3.4.

Hydrolyzáty připravené podle bodu 5.3.2.3 nebo 5.3.2.4 se částečně zneutralizují opatrným přidáním 17 ml roztoku hydroxidu sodného (bod 3.17) za stálého míchání, přičemž je třeba dbát na to, aby teplota neklesla pod 40 °C.

pH se upraví na 2,20 roztokem hydroxidu sodného (bod 3.17) a nakonec roztokem hydroxidu sodného (bod 3.18) při laboratorní teplotě. Dále se postupuje podle bodu 5.3.4.

5.3.4.    Roztok vzorku pro chromatografii

Hydrolyzát (bod 5.3.3.1 nebo 5.3.3.2) s upraveným pH se kvantitativně převede pomocí citrátového tlumivého roztoku (bod 3.24) do 200 ml odměrné baňky a doplní se po značku tlumivým roztokem (bod 3.24).

Nebyl-li dosud použit vnitřní standard, přidají se 2,00 ml vnitřního standardu (bod 3.27.3) a potom se doplní po značku citrátovým tlumivým roztokem (bod 3.24). Důkladně se promíchá.

Dále se pokračuje v chromatografii (bod 5.4).

Nejsou-li roztoky vzorků zkoušeny týž den, uchovávají se při teplotě pod 5 °C.

5.4.    Chromatografie

Před chromatografií musí mít extrakt (bod 5.2) nebo hydrolyzát (bod 5.3.4) laboratorní teplotu. Směs se protřepe a potřebné množství se přefiltruje 0,22μm membránovým filtrem (bod 4.5). Výsledný čirý roztok se podrobí ionexové chromatografii s použitím analyzátoru aminokyselin (bod 4.9).

Nástřik lze provést ručně nebo automaticky. Přitom je důležité, aby se do kolony přidávalo stejné množství roztoku ± 0,5 % pro analýzu standardů a vzorků s výjimkou případu, kdy je použit vnitřní standard. Rovněž poměr sodíku a aminokyselin by měl být v standardních roztocích a v roztocích vzorků co možná nejpodobnější.

Frekvence kalibrace závisí hlavně na stabilitě ninhydrinového činidla a analytickém systému. Standard nebo vzorek se ředí citrátovým tlumivým roztokem (bod 3.24) tak, aby plocha píku standardu tvořila 30–200 % plochy píku aminokyseliny ve vzorku.

Chromatografie aminokyselin se mírně liší v závislosti na typu použitého analyzátoru a použité pryskyřice. Zvolený systém musí být schopen separovat jednotlivé aminokyseliny od sebe navzájem i od ostatních ninhydrin-pozitivních materiálů. Chromatografický systém musí v rozsahu měření poskytovat lineární odezvu na změny obsahu aminokyselin přidaných do kolony.

Při zkoušení equimolárního roztoku (stanovovaných aminokyselin) by mělo být při chromatografii dosaženo níže uvedených poměrů výšky sedla k vrcholu píku. Tento equimolární roztok musí obsahovat nejméně 30 % maximálního obsahu jednotlivých aminokyselin, což může být přesně měřeno na použitém analyzátoru aminokyselin (bod 4.9).

Při separaci threoninu a serinu nesmí poměr výšky sedla k vrcholu nižšího z píků těchto dvou překrývajících se aminokyselin na chromatogramu přesahovat 2:10 (pokud se stanovuje pouze cyst(e)in, methionin, threonin a lysin, je stanovení nepříznivě ovlivněno nedostatečnou separací od přilehlých píků). Pro všechny ostatní aminokyseliny musí být separace lepší než 1:10.

Systém musí zaručit, že lysin bude separován od „lysinových náhražek“ a ornithinu.

6.    Výpočet výsledků

Plocha píků vzorku a standardu se měří pro každou jednotlivou aminokyselinu a vypočte se množství (X) aminokyseliny v g na kg vzorku.

Je-li použit vnitřní standard, násobí se výsledek:

A

=

plocha píku hydrolyzátu nebo extraktu

B

=

plocha píku kalibračního standardního roztoku

C

=

plocha píku vnitřního standardu v hydrolyzátu nebo v extraktu

D

=

plocha píku vnitřního standardu v kalibračním standardním roztoku

M

=

molekulární hmotnost stanovované aminokyseliny

c

=

koncentrace standardu v μmol/ml

m

=

hmotnost vzorku v g (korigovaná na původní hmotnost, pokud je vzorek vysušen nebo odtučněn)

V

=

celkový objem hydrolyzátu (bod 5.3.4) v ml nebo celkový objem zředěného extraktu (bod 6.1)

Cystin a cystein se v hydrolyzátech oxidovaného vzorku stanoví jako kyselina cysteová, ale vypočtou se jako cystin (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) s použitím MV 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Methionin se v hydrolyzátech oxidovaného vzorku stanoví jako methioninsulfon, ale vypočte se jako methionin s použitím M methioninu: 149,21 g/mol.

Přidaný volný methionin se stanoví po extrakci jako methionin, pro výpočet se použije stejná M.

V

=

objem výsledného extraktu.

7.    Evaluace metody

Tato metoda byla vyzkoušena v mezinárodní srovnávací studii v roce 1990 při použití čtyř různých krmiv (krmná směs pro prasata, krmná směs pro brojlery, proteinový koncentrát, premix).

Po vyloučení odlehlých hodnot jsou výsledky mezinárodní srovnávací studie z roku 1990 u středních a standardních odchylek uvedeny v tabulkách v tomto bodě:

7.1.    Opakovatelnost

Opakovatelnost vyjádřená jako „vnitrolaboratorní standardní odchylka“ u srovnání podle předcházející tabulky je uvedena v následujících tabulkách:

7.2.    Reprodukovatelnost

Výsledky pro mezilaboratorní standardní odchylku vyplývající z výše uvedeného srovnání jsou uvedeny v následující tabulce:

8.    Použití referenčních materiálů

Správné použití uvedené metody se ověří opakovaným měřením certifikovaných referenčních materiálů, jsou-li k dispozici. Doporučuje se kalibrace certifikovanými kalibračními roztoky aminokyselin.

9.    Poznámky

U všech aminokyselin je nutno zkontrolovat rozsah lineární odezvy přístroje.

Standardní roztok se ředí citrátovým tlumivým roztokem tak, aby se dosáhlo ploch píků uprostřed tohoto rozsahu.

10.    Kritéria účinnosti

Kompilace výsledků (s výjimkou tyrosinu) pocházejících ze dvou kolaborativních studií (z roku 1990 uvedené v bodě 7 výše a z roku 2005 uvedené v normě EN ISO 13903) udává následující kritéria pro opakovatelnost a reprodukovatelnost. Hodnoty odvozené z těchto dvou mezilaboratorních zkoušek nemusí být použitelné pro jiné než uvedené rozsahy koncentrací a matrice.

10.1    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených u téhož vzorku v téže laboratoři a týmž laborantem nesmí překročit:

10.2    Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených u téhož vzorku v různých laboratořích a/nebo různými laboranty nesmí překročit:

F.   STANOVENÍ OBSAHU TRYPTOFANU

Metody analýzy, které se mají použít pro stanovení obsahu tryptofanu, jsou:

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu v krmivech. Nerozlišuje mezi D- a L- formou.

2.    Princip

Pro stanovení celkového tryptofanu se vzorek hydrolyzuje za alkalických podmínek nasyceným roztokem hydroxidu barnatého při 110 °C po dobu 20 hodin. Po hydrolýze se přidává vnitřní standard.

Pro stanovení volného tryptofanu se vzorek extrahuje za mírně kyselých podmínek v přítomnosti vnitřního standardu.

Tryptofan a vnitřní standard se stanoví v hydrolyzátu nebo extraktu metodou HPLC s fluorescenční detekcí.

3.    Činidla

40,0 g NaOH (bod 3.5) se rozpustí ve vodě a vodou (bod 3.1) se doplní na 1 litr.

492 ml HCl (bod 3.7) se doplní vodou na 1 litr.

82 ml HCl (bod 3.7) se doplní vodou na 1 litr.

8,2 ml HCl (bod 3.7) se doplní vodou na 1 litr.

34 ml kyseliny fosforečné (bod 3.6) se doplní vodou (bod 3.1) na 1 litr.

v 500 ml odměrné baňce se rozpustí 0,2553 g tryptofanu (bod 3.2) v kyselině chlorovodíkové (bod 3.13) a doplní se jí po značku. Skladuje se při –18 °C nejdéle 4 týdny.

v 500 ml odměrné baňce se rozpustí 0,2728 g α-methyl-tryptofanu (bod 3.3) v kyselině chlorovodíkové (bod 3.13) a doplní se jí po značku. Skladuje se při –18 °C nejdéle 4 týdny.

2,00 ml koncentrovaného roztoku tryptofanu (bod 3.15) a 2,00 ml koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (α-methyl-tryptofanu) (bod 3.16) se zředí vodou (bod 3.1) a methanolem (bod 3.8) přibližně na stejný objem a přibližně na stejnou koncentraci methanolu (10–30 %) jako v konečném hydrolyzátu.

Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Během přípravy musí být roztok chráněn před slunečním světlem.

4.    Přístroje

5.    Postup

5.1.    Příprava vzorků

Vzorek se rozemele tak, aby prošel sítem s oky o velikosti 0,5 mm. Vzorky s vysokou vlhkostí se musí před mletím vysušit buď na vzduchu při teplotě nepřesahující 50 °C, nebo mrazovým sušením. Vzorky s vysokým obsahem tuku se před mletím extrahují petroletherem (bod 3.9).

5.2.    Stanovení volného tryptofanu (extrakt)

Vhodné množství (1–5 g) připraveného vzorku (bod 5.1) se naváží s přesností na 1 mg do kónické baňky. Přidá se 100,0 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.13) a 5,00 ml koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (bod 3.16). Směs se třepe nebo míchá 60 minut na mechanické třepačce nebo magnetické míchačce (bod 4.7). Sediment se nechá usadit a odpipetuje se 10,0 ml supernatantu do kádinky. Přidá se 5 ml kyseliny fosforečné (bod 3.14). pH se upraví na 3 roztokem hydroxidu sodného (bod 3.10). Přidá se tolik methanolu (bod 3.8), aby jeho koncentrace v konečném objemu byla 10–30 %. Roztok se převede do odměrné baňky vhodného objemu a zředí se vodou na objem potřebný pro chromatografické stanovení (přibližně stejný objem, jako má kalibrační standardní roztok (bod 3.17)).

Před nástřikem na kolonu HPLC se přefiltruje několik ml roztoku přes 0,45μm membránový filtr (bod 4.5). Dále se postupuje podle bodu 5.4 – chromatografie.

Standardní roztok a extrakty je nutno chránit před přímým slunečním světlem. Pokud není možné provést analýzu extraktů tentýž den, extrakty lze skladovat při 5 °C nejdéle tři dny.

5.3.    Stanovení celkového tryptofanu (hydrolyzát)

Do polypropylenové baňky (4.4) se naváží 0,1–1 g připraveného vzorku (bod 5.1) s přesností na 0,2 mg. Navážka vzorku musí mít obsah dusíku přibližně 10 mg. Přidá se 8,4 g oktahydrátu hydroxidu barnatého (bod 3.4) a 10 ml vody. Promíchá se ponorným mixérem (bod 4.8) nebo na magnetické míchačce (bod 4.7). Magnet s teflonovým povrchem se ponechá ve směsi. Stěny nádoby se opláchnou 4 ml vody. Nádoba se uzavře a víčko se volně dotáhne. Uzavřená nádoba se umístí do autoklávu (bod 4.6) s vroucí vodou a nechá se působit pára po dobu 30–60 minut. Potom se autokláv uzavře a směs se autoklávuje 20 hodin při teplotě 110 (± 2) °C.

Před otevřením autoklávu se sníží teplota těsně pod 100 °C. Aby se zabránilo krystalizaci Ba(OH)2·8H2O, přidá se k horké směsi 30 ml vody o laboratorní teplotě. Mírně se zamíchá nebo protřepe. Přidají se 2,00 ml roztoku koncentrovaného vnitřního standardu (α-methyl-tryptofanu) (bod 3.16). Nádoba se vychladí 15 minut ve vodní lázni s ledem.

Dále se přidá 5 ml kyseliny fosforečné (bod 3.14). Nádoba se ponechá v ledové lázni a za stálého míchání se neutralizuje roztokem kyseliny chlorovodíkové (bod 3.11) a potom se pH upraví na 3,0 roztokem kyseliny chlorovodíkové (bod 3.12). Přidá se tolik methanolu, aby jeho koncentrace v konečném objemu byla 10–30 %. Roztok se převede do odměrné baňky vhodného objemu a zředí se vodou na stanovený objem, který je nutný pro chromatografické stanovení (např. 100 ml). Přídavek methanolu nesmí způsobit tvorbu sraženiny.

Před nástřikem na kolonu HPLC se přefiltruje několik ml roztoku přes 0,45μm membránový filtr (bod 4.5). Dále se postupuje podle bodu 5.4 – chromatografie.

Standardní roztok a hydrolyzáty je nutno chránit před přímým slunečním světlem. Pokud není možné provést analýzu hydrolyzátů tentýž den, hydrolyzáty lze skladovat při 5 °C nejdéle tři dny.

5.4.    Stanovení HPLC

Následující podmínky izokratické eluce jsou doporučené; lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné výsledky (viz také poznámky v bodě 9.1 a 9.2):

6.    Výpočet výsledků

Vypočte se obsah tryptofanu (X) v g na 100 g vzorku.

A

=

plocha píku vnitřního standardu v kalibračním standardním roztoku (bod 3.17)

B

=

plocha píku tryptofanu v extraktu (bod 5.2) nebo hydrolyzátu (bod 5.3)

V1

=

objem (v ml) (2 ml) koncentrovaného roztoku tryptofanu (bod 3.15) přidaného do kalibračního roztoku (bod 3.17)

c

=

koncentrace (v μmol/ml) (= 2,50) tryptofanu v koncentrovaném roztoku tryptofanu (bod 3.15) přidaném do kalibračního roztoku (bod 3.17)

V2

=

objem (v ml) (= 2,00 ml) koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (bod 3.16) přidaného při extrakci (bod 5.2) (= 5,00 ml) nebo do hydrolyzátu (bod 5.3)

C

=

plocha píku vnitřního standardu v extraktu (bod 5.2) nebo hydrolyzátu (bod 5.3)

D

=

plocha píku tryptofanu v kalibračním standardním roztoku (bod 3.17)

V3

=

objem (v ml) (= 2.00 ml) koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (bod 3.16) přidaného do kalibračního standardního roztoku (bod 3.17)

M

=

hmotnost vzorku v g (korigovaná na původní hmotnost, pokud byl vzorek vysušen a/nebo odtučněn)

M

=

molekulární hmotnost tryptofanu (= 204,23 g/mol)

7.    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit 10 % relat. z hodnoty nejvyššího výsledku.

8.    Výsledky kolaborativní studie

Za účelem certifikace metody pro hydrolýzu byla provedena v EU kolaborativní studie (4. srovnání), během níž byly analyzovány tři vzorky v až 12 laboratořích. U každého vzorku bylo provedeno pět opakovaných analýz. Výsledky jsou uvedeny v této tabulce:

Za účelem certifikace metody pro extrakci volného tryptofanu byla provedena v EU další kolaborativní studie (3. srovnání), během níž byly analyzovány dva vzorky v až 13 laboratořích. U každého vzorku bylo provedeno pět opakovaných analýz. Výsledky jsou uvedeny v této tabulce:

Za účelem certifikace metody pro hydrolýzu tryptofanu byla provedena v EU další srovnávací studie, během níž byly analyzovány čtyři vzorky v až 7 laboratořích. Výsledky jsou uvedeny níže. U každého vzorku bylo provedeno pět opakovaných analýz.

9.    Poznámky

Po izokratické eluci následuje gradientové čištění kolony:

Chromatografický systém musí v rozsahu měření poskytovat lineární odezvu. Lineární odezva se měří s konstantní (běžnou) koncentrací vnitřního standardu a různými koncentracemi tryptofanu. Je důležité, aby velikost píků tryptofanu i vnitřního standardu byla v lineárním rozsahu HPLC/fluorescenčního systému. Pokud je (jsou) pík(y) tryptofanu a/nebo vnitřního standardu příliš velký (velké) nebo příliš malý (malé), analýza se zopakuje s jinou velikostí vzorku a/nebo s jiným konečným objemem.

9.3.    Hydroxid barnatý

Stárnutím hydroxidu barnatého se zhoršuje jeho rozpustnost, což způsobuje, že roztok pro stanovení HPLC není čirý a výsledky obsahu tryptofanu mohou být nízké.

G.   STANOVENÍ OBSAHU HRUBÝCH OLEJŮ A TUKŮ

1.    Účel a oblast použití

Touto metodou se stanoví obsah hrubých olejů a tuků v krmivech.

Podle druhu a složení krmiva a podle účelu, pro který se analýza provádí, se použije jeden ze dvou níže uvedených postupů.

Pro stanovení obsahu hrubých olejů a tuků v olejnatých semenech a plodech, jakož i v krmivech, v nichž je obsah hrubých olejů/tuků vyšší než 15 %, se extrakce provádí postupem A a opětovná extrakce postupem B (bod 5.3).

1.1.   Postup A – přímo extrahovatelné hrubé oleje a tuky

Tato metoda je použitelná pro krmiva rostlinného původu s výjimkou těch, která jsou uvedena v postupu B.

1.2.   Postup B – celkový obsah hrubých olejů a tuků

Tato metoda je použitelná pro krmiva živočišného původu a pro všechny krmné směsi. Má se používat pro všechny materiály, z nichž není možné oleje a tuky zcela extrahovat bez předchozí hydrolýzy (např. lepek, kvasnice, bramborové proteiny a produkty, které byly podrobeny zpracování, jako je extruze, vločkování a ohřev).

1.3.    Interpretace výsledků

Ve všech případech, kdy se dosáhlo postupem B vyššího výsledku než postupem A, je třeba považovat za platnou hodnotu výsledek dosažený postupem B.

2.    Princip

2.1.    Postup A

Vzorek se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se oddestiluje, zbytek se vysuší a zváží.

2.2.    Postup B

Vzorek se hydrolyzuje za horka s kyselinou chlorovodíkovou. Směs se ochladí a přefiltruje. Zbytek na filtru se promyje a vysuší a dále se pokračuje ve stanovení podle postupu A.

3.    Činidla

4.    Přístroje

5.    Postup

5.1.   Postup A (viz bod 8.1)

Do extrakční patrony (bod 4.2) se naváží 5 g vzorku s přesností na 1 mg a patrona se uzavře tukuprostou vatou.

Patrona se umístí do extrakčního přístroje (bod 4.1) a extrahuje se šest hodin petroletherem (bod 3.1). Petroletherový extrakt se jímá do suché, předem zvážené baňky s úlomky pemzy ( 17 ).

Rozpouštědlo se oddestiluje, zbytek v baňce se vysuší 1,5 hodiny v sušárně (bod 4.3). Nechá se vychladnout v exsikátoru a zváží se. Suší se dalších 30 minut, aby se zajistila konstantní hmotnost olejů a tuků (úbytek hmotnosti mezi dvěma po sobě následujícími váženími nesmí být větší než 1 mg).

5.2.    Postup B

Do 400 ml kádinky nebo do 300 ml kónické baňky se naváží 2,5 g vzorku s přesností na 1 mg (viz bod 8.2) a přidá se 100 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.3) a úlomky pemzy. Kádinka se přikryje hodinovým sklem nebo se ke kónické baňce připojí zpětný chladič. Směs se přivede do mírného varu nad malým plamenem nebo na topné desce a udržuje se tak jednu hodinu. Produkt se nesmí usazovat na stěnách nádoby.

Směs se vychladí a přidá se dostatečné množství filtračního prostředku (bod 3.4), aby se zabránilo ztrátám oleje a tuku během filtrace. Filtruje se přes zvlhčený, tukuprostý dvojitý filtrační papír. Zbytek na filtru se promývá studenou vodou, dokud není filtrát neutrální. Provede se kontrola, zda filtrát neobsahuje žádný olej nebo tuk, jinak je nutné před hydrolýzou provést extrakci vzorku petroletherem podle postupu A.

Dvojitý filtrační papír se zbytkem po hydrolýze se umístí na hodinové sklo a suší se 1,5 hodiny ve vzduchové sušárně (bod 4.3) při 100 ± 3 °C.

Dvojitý filtrační papír s vysušeným zbytkem se vloží do extrakční patrony (bod 4.2) a utěsní se tukuprostou vatou. Patrona se umístí do extrakčního přístroje (bod 4.1) a dále se postupuje podle druhého a třetího odstavce bodu 5.1.

5.3.    Postup A a opětovná extrakce podle postupu B

Pro stanovení obsahu hrubých olejů a tuků v olejnatých semenech a plodech, jakož i v krmivech, v nichž je obsah hrubých olejů/tuků vyšší než 15 %, se extrakce provádí postupem A a opětovná extrakce postupem B.

To znamená, že po extrakci petroletherem (postup A) se zbytek nebo část zbytku znovu extrahuje kyselinou chlorovodíkovou (postup B). Obsah hrubých olejů a tuků je součtem výsledků postupů A a B.

6.    Vyjádření výsledku

Hmotnost zbytku se vyjádří jako procento vzorku.

7.    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku týmž laborantem nesmí překročit:

8.    Poznámky

Naváží se 20 g vzorku s přesností na 1 mg, promíchá se s 10 nebo více gramy bezvodého síranu sodného (bod 3.2). Extrahuje se petroletherem (bod 3.1) podle bodu 5.1. Získaný extrakt se doplní petroletherem (bod 3.1) na objem 500 ml a promíchá. Do malé, suché, předem zvážené baňky s úlomky pemzy se odměří 50 ml tohoto roztoku. Rozpouštědlo se oddestiluje a po vysušení se postupuje podle posledního odstavce bodu 5.1.

Ze zbytku po extrakci v patroně se odstraní veškeré rozpouštědlo a zbytek se umele tak, aby prošel sítem s oky 1 mm. Potom se vrátí do extrakční patrony (síran sodný se již nepřidává) a postupuje se podle druhého a třetího odstavce bodu 5.1.

Obsah olejů a tuků se vypočte jako procento vzorku podle tohoto vzorce:

kde:

m1

=

hmotnost zbytku po první extrakci v gramech (alikvotní části extraktu),

m2

=

hmotnost zbytku po druhé extrakci v gramech.

H.   STANOVENÍ OBSAHU HRUBÉ VLÁKNINY

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovit v krmivu obsah tukuprostých organických látek, které jsou nerozpustné v roztoku kyseliny a zásady a jsou běžně nazývány hrubá vláknina.

Tato metoda není použitelná v případě lignocelulózy a rostlinného uhlí (příliš jemné částice).

2.    Princip

Vzorek se v případě potřeby odtuční a působí se na něj postupně vroucím roztokem kyseliny sírové a hydroxidu draselného o přesně stanovené koncentraci. Zbytek se oddělí filtrací přes skleněný filtrační kelímek, promyje, vysuší, zváží a spálí při teplotě 475–500 °C. Úbytek váhy po spálení odpovídá obsahu hrubé vlákniny ve zkušebním vzorku.

3.    Činidla

4.    Přístroje

5.    Postup

Do filtračního kelímku (bod 4.2) se naváží 1 g připraveného vzorku s přesností na 1 mg (viz poznámky v bodech 9.1, 9.2 a 9.3) a přidá se 1 g filtrační pomůcky (bod 3.3).

Filtrační kelímek (bod 4.2) se připojí k zahřívací jednotce (bod 4.1) a poté k hydrolyzační nádobce (bod 4.3). Do spojené hydrolyzační nádobky a filtračního kelímku se nalije 150 ml vroucího roztoku kyseliny sírové (bod 3.1) a v případě potřeby se přidá několik kapek odpěňovacího činidla (bod 3.2).

Kapalina se přivede během 5 ± 2 minut do varu a intenzivně se vaří přesně 30 minut.

Otevře se vypouštěcí ventil (bod 4.1) a kyselina sírová se odsaje za použití vakua přes filtrační kelímek a zbytek se promyje třikrát 30 ml vroucí vody, vždy do úplného odsátí po každém promytí.

Vypouštěcí ventil se uzavře, přidá se 150 ml vroucího roztoku hydroxidu draselného (bod 3.7) do spojené hydrolyzační nádobky a filtračního kelímku a přidá se několik kapek odpěňovacího činidla (bod 3.2). Kapalina se přivede během 5 ± 2 minut do varu a intenzivně se vaří přesně 30 minut. Přefiltruje se a zopakuje se promývání jako u kyseliny sírové.

Po skončení promývání a odsávání se filtrační kelímek se svým obsahem odpojí a připojí se ke studené extrakční jednotce (bod 4.6). Za použití vakua se zbytek promyje ve filtračním kelímku třikrát 25 ml acetonu (bod 3.4), vždy do úplného odsátí po každém promytí.

Filtrační kelímek se vysuší do konstantní hmotnosti v sušárně při teplotě 130 °C. Po každém vysušení a ochlazení v exsikátoru se vždy rychle zváží. Filtrační kelímek se vloží do muflové pece a spaluje při 475–500 °C nejméně 30 minut do konstantní hmotnosti (úbytek hmotnosti mezi dvěma po sobě následujícími váženími nesmí být větší než 2 mg).

Po každém spalování a ochlazení nejprve v peci a potom v exsikátoru se zváží.

Provede se slepá zkouška bez zkoušeného vzorku. Úbytek hmotnosti po spalování nesmí být větší než 4 mg.

6.    Výpočet výsledků

Obsah hrubé vlákniny jako procento vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

m

=

hmotnost vzorku v g,

m0

=

úbytek hmotnosti po spálení při vlastním stanovení v g,

m1

=

úbytek hmotnosti po spálení při slepé zkoušce v g.

7.    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit:

8.    Reprodukovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení provedených u téhož vzorku v různých laboratořích nesmí překročit:

9.    Poznámky

I.   STANOVENÍ OBSAHU CUKRŮ

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu redukujících cukrů a celkového obsahu cukrů po inverzi vyjádřených jako glukóza nebo v příslušném případě sacharóza s použitím faktoru 0,95. Je použitelná pro krmné směsi. Pro ostatní krmiva jsou používány zvláštní metody. Je-li to nutné, může být obsah laktózy měřen zvlášť a potom zahrnut do celkového výsledku.

Tato metoda se použije pro stanovení obsahu cukrů pro výpočet energetické hodnoty krmiva.

Má-li být obsah cukrů stanoven pro jiné účely, lze použít jiné metody analýzy.

2.    Princip

Cukry se vyextrahují zředěným ethanolem. Roztok se vyčeří Carrezovými činidly I a II. Ethanol se odstraní a množství cukrů před inverzí a po inverzi se stanoví Luff-Schoorlovou metodou.

3.    Činidla

Za opatrného míchání se nalije roztok kyseliny citronové (bod 3.8.2) do roztoku uhličitanu sodného (bod 3.8.3). Přidá se roztok síranu měďnatého (bod 3.8.1) a doplní se vodou na 1 litr. Nechá se přes noc usadit a pak se přefiltruje.

Zkontroluje se koncentrace takto získaného činidla (Cu – 0,05 mol/l; Na2CO3 – 1 mol/l), viz poslední odstavec bodu 5.4. pH tohoto roztoku musí být přibližně 9,4.

4.    Přístroje

Míchací zařízení: přibližně 35 až 40 ot/min.

5.    Postup

5.1.    Extrakce vzorku

Do 250 ml odměrné baňky se naváží 2,5 g vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 200 ml ethanolu (bod 3.1) a míchá se po dobu jedné hodiny na míchacím zařízení. Přidá se 5 ml Carrezova činidla I (bod 3.2) a míchá se přibližně 30 sekund. Přidá se 5 ml Carrezova činidla II (bod 3.3) a znovu se míchá jednu minutu. Doplní se po značku ethanolem (bod 3.1), homogenizuje a přefiltruje. Odpipetuje se 200 ml filtrátu a odpaří se na přibližně polovinu objemu, aby se odstranila většina ethanolu. Zbytek po odpařování se kvantitativně převede do 200 ml odměrné baňky pomocí teplé vody, zchladí se, doplní se vodou po značku, homogenizuje a v případě potřeby přefiltruje. Tento roztok se použije pro stanovení obsahu redukujících cukrů a po inverzi pro stanovení celkového obsahu cukrů.

5.2.    Stanovení redukujících cukrů

Odpipetuje se maximálně 25 ml roztoku, který obsahuje méně než 60 mg redukujících cukrů vyjádřených jako glukóza. V případě potřeby se odpipetovaný objem doplní destilovanou vodou na 25 ml. Obsah redukujících cukrů se stanoví Luff-Schoorlovou metodou. Výsledek se vyjádří jako procentní obsah glukózy ve vzorku.

5.3.    Stanovení celkového obsahu cukrů po inverzi

Do 100 ml odměrné baňky se odpipetuje 50 ml roztoku. Přidá se několik kapek roztoku methyloranže (bod 3.4) a potom se za stálého, opatrného míchání přidá kyselina chlorovodíková (bod 3.5), až se kapalina trvale zbarví do červena. Poté se přidá 15 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.6) a baňka se ponoří do silně vroucí vodní lázně, kde se ponechá 30 minut. Rychle se vychladí na přibližně 20 °C a přidá se 15 ml roztoku hydroxidu sodného (bod 3.7). Doplní se vodou do 100 ml a homogenizuje. Odpipetuje se maximálně 25 ml roztoku, který obsahuje méně než 60 mg redukujících cukrů vyjádřených jako glukóza. V případě potřeby se odpipetovaný objem doplní destilovanou vodou na 25 ml a obsah redukujících cukrů se stanoví Luff-Schoorlovou metodou. Výsledek se vyjádří jako procento glukózy nebo, v příslušném případě, sacharózy po vynásobení faktorem 0,95.

5.4.    Titrace Luff-Schoorlovou metodou

Do 300 ml Erlenmeyerovy baňky se odpipetuje 25 ml Luff-Schoorlova činidla (bod 3.8); přidá se přesně 25 ml vyčeřeného cukerného roztoku. Přidají se dvě granule pemzy (bod 3.13) a při ručním míchání se zahřívá nad otevřeným plamenem střední délky tak, aby se kapalina přivedla přibližně během dvou minut do varu. Pak se Erlenmeyerova baňka neprodleně umístí na azbestem potaženou drátěnou síťku s otvorem o průměru přibližně 6 cm, pod kterou byl zapálen plamen. Tento plamen musí být regulován tak, aby se zahřívalo pouze dno Erlenmeyerovy baňky. K Erlenmeyerově baňce se připojí zpětný chladič vaří se přesně deset minut. Potom se baňka ihned ochladí ve studené vodě a přibližně po pěti minutách se titruje takto:

Do baňky se přidá 10 ml roztoku jodidu draselného (bod 3.12) a ihned poté (opatrně, vzhledem k riziku nadměrného pěnění) se přidá 25 ml kyseliny sírové (bod 3.11). Titruje se roztokem thiosíranu sodného (bod 3.9), až se objeví kalně žlutá barva. Pak se přidá škrobový indikátor (bod 3.10) a titrace se dokončí.

Stejná titrace se provede s přesně odměřenou směsí 25 ml Luff-Schoorlova činidla (bod 3.8) a 25 ml vody, po přidání 10 ml roztoku jodidu draselného (bod 3.12) a 25 ml kyseliny sírové (bod 3.11) bez vaření.

6.    Výpočet výsledků

S použitím tabulky se stanoví obsah glukózy v mg, který odpovídá rozdílu mezi hodnotami obou titrací vyjádřených v ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l. Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

7.    Zvláštní postupy

Homogenizuje se a přefiltruje. Ethanol se odstraní postupem uvedeným v bodě 5.1. Pokud ve směsi není žádný dextrinovaný škrob, doplní se po značku destilovanou vodou.

8.    Poznámky

V obou případech se obsah přítomného cukru stanoví Luff-Schoorlovou metodou a vyjádří v mg glukózy. Jedna hodnota se odečte od druhé a rozdíl se vyjádří jako procento vzorku.

Příklad

Oba objemy odpovídají pro každé stanovení vzorku o hmotnosti 250 mg.

V prvním případě je spotřebováno 17 ml roztoku thiosíranu sodného s koncentrací 0,1 mol/l, což odpovídá 44,2 mg glukózy. V druhém případě je spotřebováno 11 ml téhož roztoku, což odpovídá 27,6 mg glukózy.

Rozdíl činí 16,6 mg glukózy.

Obsah redukujících cukrů (s výjimkou laktózy) vyjádřených jako glukóza je tedy:

J.   STANOVENÍ OBSAHU LAKTÓZY

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu laktózy v krmivech obsahujících více než 0,5 % laktózy.

2.    Princip

Cukry se rozpustí ve vodě. Roztok se vystaví fermentačnímu účinku kvasinek Saccharomyces cerevisiae, které ponechají laktózu v nezměněném stavu. Po vyčeření a filtraci se obsah laktózy ve filtrátu stanoví Luff-Schoorlovou metodou.

3.    Činidla

Za opatrného míchání se nalije roztok kyseliny citronové (bod 3.4.2) do roztoku uhličitanu sodného (bod 3.4.3). Přidá se roztok síranu měďnatého (bod 3.4.1) a doplní se vodou na 1 litr. Nechá se přes noc usadit a pak se přefiltruje. Zkontroluje se koncentrace takto získaného činidla (Cu – 0,05 mol/l; Na2CO3 1 mol/l). pH tohoto roztoku musí být přibližně 9,4.

4.    Přístroje

Vodní lázeň s termostatem nastaveným na 38–40 °C.

5.    Postup

Do 100 ml odměrné baňky se naváží 1 g vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 25–30 ml vody. Baňka se umístí do vroucí vodní lázně na 30 minut a potom se ochladí na teplotu přibližně 35 °C. Přidá se 5 ml suspenze kvasinek (bod 3.1) a homogenizuje. Obsah baňky se nechá stát po dobu dvou hodin ve vodní lázni o teplotě 38–40 °C a potom se ochladí na teplotu přibližně 20 °C.

Přidá se 2,5 ml Carrezova činidla I (bod 3.2) a 30 sekund se míchá. Potom se přidá 2,5 ml Carrezova činidla II (bod 3.3) a znovu se míchá 30 sekund. Doplní se vodou na 100 ml, zamíchá se a přefiltruje. Do 300 ml Erlenmeyerovy baňky se odpipetuje část filtrátu, nejvýše 25 ml, která obsahuje pokud možno 40–80 mg laktózy. Pokud je třeba, doplní se vodou na 25 ml.

Stejným způsobem se provede slepá zkouška s 5 ml suspenze kvasinek (bod 3.1). Stanoví se obsah laktózy Luff-Schoorlovou metodou tímto způsobem: přidá se přesně 25 ml Luff-Schoorlova činidla (bod 3.4) a dvě granule pemzy (bod 3.5). Při ručním míchání se zahřívá nad otevřeným plamenem střední délky tak, aby se kapalina přivedla přibližně během dvou minut do varu. Pak se Erlenmeyerova baňka neprodleně umístí na azbestem potaženou drátěnou síťku s otvorem o průměru přibližně 6 cm, pod kterou byl zapálen plamen. Tento plamen musí být regulován tak, aby se zahřívalo pouze dno Erlenmeyerovy baňky. K Erlenmeyerově baňce se připojí zpětný chladič. Vaří se přesně deset minut. Potom se baňka ihned ochladí ve studené vodě a přibližně po pěti minutách se titruje takto:

Přidá se 10 ml roztoku jodidu draselného (bod 3.6) a ihned poté (opatrně, vzhledem k riziku nadměrného pěnění) se přidá 25 ml kyseliny sírové (bod 3.7). Titruje se roztokem thiosíranu sodného (bod 3.8), až se objeví kalně žlutá barva. Pak se přidá škrobový indikátor (bod 3.9) a titrace se dokončí.

Stejná titrace se provede s přesně odměřenou směsí 25 ml Luff-Schoorlova činidla (bod 3.4) a 25 ml vody, po přidání 10 ml roztoku jodidu draselného (bod 3.6) a 25 ml kyseliny sírové (bod 3.7) bez vaření.

6.    Výpočet výsledků

S použitím tabulky uvedené níže se stanoví obsah laktózy v mg, který odpovídá rozdílu mezi výsledky dvou titrací, vyjádřených v ml roztoku thiosíranu sodného 0,1 mol/l.

Výsledek se vyjádří jako bezvodá laktóza vyjádřená jako procento vzorku.

7.    Poznámka

K.   STANOVENÍ OBSAHU ŠKROBU

– POLARIMETRICKÁ METODA –

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu škrobu a degradačních produktů škrobu s vysokou molekulární hmotností v krmivech za účelem kontroly shody s deklarovanou energetickou hodnotou (ustanovení v příloze VII) a s nařízením (ES) č. 767/2009.

Tato metoda se použije pro stanovení obsahu škrobu pro výpočet energetické hodnoty krmiva.

Má-li být obsah škrobu stanoven pro jiné účely, lze použít jiné metody analýzy.

2.    Princip

Metoda zahrnuje dvě stanovení. V prvním stanovení je vzorek podroben působení zředěné kyseliny chlorovodíkové. Po vyčeření a filtraci je polarimetricky měřena optická otáčivost roztoku.

V druhém stanovení je vzorek extrahován 40 % ethanolem. Po okyselení filtrátu kyselinou chlorovodíkovou, vyčeření a filtraci je optická otáčivost roztoku měřena stejně jako u prvního stanovení.

Rozdíl mezi těmito dvěma měřeními násobený známým faktorem udává obsah škrobu ve vzorku.

3.    Činidla

Koncentrace se musí zkontrolovat titrací za použití roztoku hydroxidu sodného 0,1 mol/l a přítomnosti 0,1 % (w/v) methylčerveně v 94 % (v/v) ethanolu. Pro neutralizaci 10 ml je zapotřebí 30,94 ml NaOH 0,1 mol/l.

4.    Přístroje

5.    Postup

5.1.    Příprava vzorku

Vzorek se rozemele tak, aby prošel sítem s kulatými oky o velikosti 0,5 mm.

5.2.   Stanovení celkové optické otáčivosti (P nebo S) (viz poznámka 7.1)

Do 100 ml odměrné baňky se naváží 2,5 g umletého vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 25 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.2), protřepe se, aby se zkušební vzorek rovnoměrně rozprostřel, a potom se přidá dalších 25 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.2). Baňka se ponoří do vroucí vodní lázně a první tři minuty se s ní intenzivně třepe, aby nedošlo k tvorbě shluků. Množství vody ve vodní lázni musí být takové, aby při ponoření baňky do lázně nedošlo k přerušení varu. Během protřepávání nesmí být baňka vyjmuta z lázně. Přesně po 15 minutách se baňka vyjme z lázně, přidá se 30 ml studené vody a ihned se ochladí na 20 °C.

Přidá se 5 ml Carrezova činidla I (bod 3.3) a přibližně 30 sekund se protřepává. Přidá se 5 ml Carrezova činidla II (bod 3.4) a opět se protřepává přibližně 30 sekund. Baňka se doplní po značku vodou, promíchá a přefiltruje. Pokud není filtrát zcela čirý (k tomu dochází pouze výjimečně), stanovení se zopakuje s použitím většího množství Carrezových činidel I a II, například 10 ml.

Optická otáčivost roztoku se měří na polarimetru nebo sacharimetru v 200 mm trubici.

5.3.    Stanovení optické otáčivosti (P’ nebo S’) látek rozpustných ve 40 % ethanolu

Do 100 ml odměrné baňky se naváží 5 g vzorku s přesností na 1 mg a přidá se asi 80 ml ethanolu (bod 3.5) (viz poznámka v bodě 7.2). Baňka se nechá stát 1 hodinu při laboratorní teplotě; během této doby se šestkrát důkladně protřepe, aby se zkušební vzorek zcela promísil s ethanolem. Doplní se ethanolem (bod 3.5) po značku, promíchá a přefiltruje.

Odpipetuje se 50 ml filtrátu (= 2,5 g vzorku) do 250 ml Erlenmeyerovy baňky, přidá se 2,1 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.1) a důkladně se protřepe. K Erlenmeyerově baňce se připojí zpětný chladič a baňka se ponoří do vroucí vodní lázně. Přesně po 15 minutách se Erlenmeyerova baňka vyjme z lázně, její obsah se převede do 100 ml odměrné baňky, varná baňka se vypláchne malým množstvím studené vody a ochladí se na 20 °C.

Potom se vyčeří Carrezovými činidly I a II (bod 3.3 a 3.4), doplní se vodou po značku, promíchá a přefiltruje. Při měření optické otáčivosti se postupuje podle druhého a třetího odstavce bodu 5.2.

6.    Výpočet výsledků

Obsah škrobu (v %) se vypočte podle těchto vzorců:

6.1.    Měření na polarimetru

P

=

celková optická otáčivost v úhlových stupních

P’

=

optická otáčivost v úhlových stupních látek rozpustných ve 40 % (v/v) ethanolu

=

specifická optická otáčivost čistého škrobu. Konvenční číselné hodnoty přijaté pro tento faktor jsou následující:

+ 185,9°

:

rýžový škrob

+ 185,7°

:

bramborový škrob

+ 184,6°

:

kukuřičný škrob

+ 182,7°

:

pšeničný škrob

+ 181,5°

:

ječný škrob

+ 181,3°

:

ovesný škrob

+ 184,0°

:

ostatní typy škrobu a škrobových směsí v krmných směsích

6.2.    Měření na sacharimetru

S

=

celková optická otáčivost ve stupních sacharizace

S’

=

optická otáčivost ve stupních sacharizace látek rozpustných ve 40 % (v/v) ethanolu

N

=

hmotnost sacharózy v g ve 100 ml vody, která poskytne ve 200 mm trubici optickou otáčivost rovnou 100o sacharizace 16,29 g pro francouzské sacharimetry 26,00 g pro německé sacharimetry 20,00 g pro směsné sacharimetry

=

specifická optická otáčivost čistého škrobu (viz bod 6.1).

6.3.    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit 0,4 v absolutní hodnotě u obsahu škrobu nižšího než 40 % a 1 % relat. u obsahu škrobu 40 % a více.

7.    Poznámky

L.   STANOVENÍ OBSAHU HRUBÉHO POPELA

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu hrubého popela v krmivech.

2.    Princip

Vzorek se zpopelní při 550 °C; zbytek se zváží.

3.    Činidla

Dusičnan amonný, roztok 20 % (w/v).

4.    Přístroje

5.    Postup

Do spalovacího kelímku, který byl předem zahřát na teplotu 550 °C, ochlazen a zvážen, se s přesností na 1 mg naváží přibližně 5 g vzorku (2,5 g v případě produktů, které mají během spalování tendenci zvětšovat svůj objem). Potom se kelímek položí na topnou desku a postupně se zahřívá, až látka zuhelnatí. Spaluje se podle bodu 5.1 nebo 5.2.

6.    Výpočet výsledků

Vypočte se hmotnost zbytku po odečtení hmotnosti kelímku (táry).

Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

7.    Poznámky

M.   STANOVENÍ OBSAHU POPELA NEROZPUSTNÉHO V KYSELINĚ CHLOROVODÍKOVÉ

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu minerálních látek nerozpustných v kyselině chlorovodíkové v krmivech. Podle druhu vzorku mohou být použity dvě různé metody.

2.    Princip

3.    Činidla

4.    Přístroje

5.    Postup

5.1.    Metoda A:

Vzorek se zpopelní podle postupu uvedeného v metodě pro stanovení obsahu hrubého popela. Může se použít rovněž popel získaný při uvedeném stanovení.

Popel se pomocí 75 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.1) převede do 250–400 ml kádinky. Uvede se pomalu do varu a mírně se vaří patnáct minut. Teplý roztok se přefiltruje přes bezpopelný papírový filtr a zbytek na filtru se promyje teplou vodou do vymizení kyselé reakce. Filtr s promytým zbytkem se vysuší a potom zpopelní v předem zváženém kelímku při teplotě minimálně 550 °C a maximálně 700 °C. Nechá se vychladnout v exsikátoru a zváží se.

5.2.    Metoda B

Do 250–400 ml kádinky se naváží 5 g vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se postupně 25 ml vody a 25 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.1), promíchá se a nechá se stát, dokud neustane pěnění. Přidá se dalších 50 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.1). Po ukončení vývoje plynu se kádinka umístí na vroucí vodní lázeň, kde se ponechá 30 minut nebo v případě potřeby déle, aby mohlo dojít k hydrolýze veškerého přítomného škrobu. Přefiltruje se za horka přes bezpopelný papírový filtr a filtr se promyje 50 ml teplé vody (viz poznámka 7). Filtr se zbytkem se vloží do spalovacího kelímku, vysuší se a potom zpopelní při teplotě minimálně 550 °C a maximálně 700 °C. Po spálení se popel převede pomocí 75 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.1) do 250–400 ml kádinky; pokračuje se podle druhého odstavce bodu 5.1.

6.    Výpočet výsledků

Vypočte se hmotnost zbytku po odečtení hmotnosti kelímku (táry). Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

7.    Poznámka

Jestliže je filtrace obtížná, je možné nahradit 50 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.1) 50 ml 20 % (w/v) roztoku kyseliny trichloroctové (bod 3.2) a zbytek na filtru promývat teplým 1 % roztokem kyseliny trichloroctové (bod 3.3).

N.   STANOVENÍ OBSAHU CELKOVÉHO FOSFORU

Celkový fosfor se stanoví takto:

FOTOMETRICKÁ METODA

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu celkového fosforu v krmivech. Je vhodná především pro analýzu produktů s nízkým obsahem fosforu. V určitých případech (u produktů s vysokým obsahem fosforu) je možné použít gravimetrickou metodu.

2.    Princip

Vzorek se mineralizuje buď suchou cestou (v případě organických krmiv), nebo mokrou cestou (v případě minerálních směsí a tekutých krmiv) a převede se do kyselého roztoku. K tomuto roztoku se přidá molybdátovanadátové činidlo. Optická hustota žlutě zbarveného roztoku se měří při 430 nm pomocí spektrofotometru.

3.    Činidla

4.    Přístroje

5.    Postup

5.1.    Příprava roztoku

Podle druhu vzorku se připraví roztok způsobem, který je uveden v bodě 5.1.1 nebo 5.1.2.

5.1.1.    Obvyklý postup

Do Kjeldahlovy baňky se naváží 1 g nebo větší množství vzorku s přesností na 1 mg. Přidá se 20 ml kyseliny sírové (bod 3.5), baňka se důkladně protřepe, aby se vzorek a kyselina dobře spojily a aby se zabránilo usazování vzorku na stěnách baňky; pak se roztok zahřeje a 10 minut se vaří na bodu varu. Po mírném ochlazení se přidají 2 ml kyseliny dusičné (bod 3.4); slabě se zahřeje a opět mírně ochladí. Pak se opět přidá trochu kyseliny dusičné (bod 3.4) a uvede se opět do varu. Postup se opakuje tolikrát, až se získá čirý roztok. Potom se ochladí, přidá se trochu vody, kapalina se převede do 500 ml odměrné baňky a Kjeldahlova baňka se vypláchne horkou vodou. Po ochlazení se doplní vodou po značku, homogenizuje a přefiltruje.

5.1.2.    Vzorky, které obsahují organické látky, ale neobsahují dihydrogenfosforečnan vápenatý a hořečnatý

Do spalovacího kelímku se naváží přibližně 2,5 g vzorku s přesností na 1 mg a dokonale se promíchá s 1 g uhličitanu vápenatého (bod 3.1). V muflové peci se spaluje při teplotě 550 °C tak dlouho, dokud se nezíská popel bílé nebo šedé barvy (malé množství uhlíkatých částic není na závadu). Popel se převede do 250 ml kádinky, přidá se 20 ml vody a potom se přidává kyselina chlorovodíková (bod 3.2), dokud neustane pěnění. Přidá se dalších 10 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.2). Kádinka se postaví na pískovou lázeň a odpaří se do sucha, aby se vyloučily křemičitany. Zbytek se rozpustí v 10 ml kyseliny dusičné (bod 3.3) a 5 minut vaří na pískové lázni nebo na topné desce tak, aby nedošlo k úplnému vysušení. Kapalina se převede do 500 ml odměrné baňky a kádinka se několikrát vymyje horkou vodou. Po ochlazení se doplní vodou po značku, homogenizuje a přefiltruje.

5.2.    Vývoj zbarvení a měření optické hustoty

Alikvotní množství filtrátu připraveného podle bodu 5.1.1 nebo 5.1.2 se zředí tak, aby koncentrace fosforu byla maximálně 40 μg/ml. 10 ml tohoto roztoku se odpipetuje do zkumavky (bod 4.6) a přidá se 10 ml molybdátovanadátového činidla (bod 3.6). Homogenizuje se a nechá se stát minimálně po dobu 10 minut při teplotě 20 °C. Pak se měří optická hustota ve spektrofotometru při 430 nm proti roztoku připravenému z 10 ml vody a 10 ml molybdátovanadátového činidla (bod 3.6).

5.3.    Kalibrační křivka

Ze standardního roztoku (bod 3.7) se připraví roztoky, které obsahují 5, 10, 20, 30 a 40 μg fosforu na jeden ml. Ke každým 10 ml těchto roztoků se přidá 10 ml molybdátovanadátového činidla (bod 3.6). Homogenizuje se a nechá se stát minimálně po dobu 10 minut při teplotě 20 °C. Pak se měří optická hustota, jak je uvedeno v bodě 5.2. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením hodnot optické hustoty proti odpovídajícím množstvím fosforu. Křivka je lineární při koncentraci fosforu 0–40 μg/ml.

6.    Výpočet výsledků

Obsah fosforu ve zkušebním vzorku se stanoví pomocí kalibrační křivky.

Výsledek se vyjádří jako procento vzorku.

Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit:

O.   STANOVENÍ OBSAHU VE VODĚ ROZPUSTNÝCH CHLORIDŮ

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu ve vodě rozpustných chloridů obvykle vyjadřovaných jako chlorid sodný. Je vhodná pro všechna krmiva.

2.    Princip

Chloridy se rozpustí ve vodě. Jestliže produkt obsahuje organickou hmotu, roztok se vyčeří. Roztok se mírně okyselí kyselinou dusičnou a chloridy se vysrážejí pomocí roztoku dusičnanu stříbrného jako chlorid stříbrný. Přebytek dusičnanu stříbrného se titruje roztokem thiokyanatanu amonného podle Volhardovy metody.

3.    Činidla

4.    Přístroje

Míchací zařízení: přibližně 35 až 40 ot/min.

5.    Postup

5.1.    Příprava roztoku

Příprava vzorku závisí na druhu vzorku a roztok se připraví podle bodu 5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3.

Současně se provede slepá zkouška bez zkoušeného vzorku.

5.1.1.    Vzorky prosté organické hmoty

Do 500 ml odměrné baňky se naváží maximálně 10 g vzorku s přesností na 1 mg tak, aby navážka obsahovala nejvýše 3 g ve vodě rozpustných chloridů, přidá se 400 ml vody o teplotě přibližně 20 °C a míchá se 30 minut na míchacím zařízení. Potom se doplní po značku, homogenizuje a přefiltruje.

5.1.2.    Vzorky obsahující organickou hmotu, kromě produktů uvedených v bodě 5.1.3

Do 500 ml odměrné baňky se naváží přibližně 5 g vzorku s přesností na 1 mg a 1 g aktivního uhlí. Přidá se 400 ml vody o teplotě přibližně 20 °C a 5 ml Carrezova činidla I (bod 3.7), asi 30 sekund se míchá, pak se přidá 5 ml Carrezova činidla II (bod 3.8). Míchá se 30 minut na míchacím zařízení, potom se doplní po značku, homogenizuje a přefiltruje.

5.1.3.    Tepelně opracovaná krmiva, lněné pokrutiny, lněná moučka, produkty bohaté na lněnou moučku a jiné produkty bohaté na sliz nebo koloidní látky (např. dextrinovaný škrob)

Roztok se připraví podle bodu 5.1.2, ale nefiltruje se. Dekantuje se (v případě potřeby odstředí). Do 200 ml odměrné baňky se odpipetuje 100 ml supernatantu, smíchá se s acetonem (bod 3.6) a doplní se tímto rozpouštědlem po značku, homogenizuje se a přefiltruje.

5.2.    Titrace

Do Erlenmeyerovy baňky se odpipetuje 25–100 ml filtrátu (podle předpokládaného obsahu chloru) získaného podle bodu 5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3. Alikvotní část nesmí obsahovat více než 150 mg chloru (Cl). V případě potřeby se doplní vodou na minimálně 50 ml, přidá se 5 ml kyseliny dusičné (bod 3.4), 2 ml nasyceného roztoku síranu železitoamonného (bod 3.3) a dvě kapky roztoku thiokyanatanu amonného (bod 3.1) z byrety naplněné ke značce nula. Jinou byretou se přidá roztok dusičnanu stříbrného (bod 3.2) tak, aby se získal přebytek 5 ml. Dále se přidá 5 ml diethyletheru (bod 3.5) a silně se protřepe, aby sraženina dobře koagulovala. Přebytek dusičnanu stříbrného se titruje s roztokem thiokyanatanu amonného (bod 3.1), dokud není dosaženo červenohnědého zabarvení, které vydrží jednu minutu.

6.    Výpočet výsledků

Obsah ve vodě rozpustných chloridů (X) vyjádřených jako procento chloridu sodného se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

V1

=

přidaný roztok dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l v ml

V2

=

roztok thiokyanatanu amonného 0,1 mol/l použitý pro titraci v ml

m

=

hmotnost vzorku v alikvotní části v g.

Jestliže byl při slepé zkoušce roztok dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l spotřebován, odečte se tato hodnota z objemu (V1 – V2).

7.    Poznámky

---

PŘÍLOHA IV

METODY ANALÝZY PRO KONTROLU OBSAHU POVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK V KRMIVECH

A)   STANOVENÍ OBSAHU VITAMINU A

Obsah vitaminu A se stanoví takto:

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu vitaminu A (retinolu) v krmivech. Vitamin A zahrnuje all-trans-retinyl-alkohol a jeho cis-izomery, které se stanoví touto metodou. Obsah vitaminu A se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách (IU) na kilogram. Jedna IU odpovídá aktivitě 0,300 μg all-trans-vitamin-A-alkoholu nebo 0,344 μg all-trans-vitamin-A-acetátu nebo 0,550 μg all-trans-vitamin-A-palmitátu.

Mez stanovitelnosti je 2 000 IU vitaminu A/kg.

2.    Princip

Vzorek se hydrolyzuje ethanolickým roztokem hydroxidu draselného a vitamin A se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se rozpustí v methanolu a, pokud je to nutné, naředí se na vhodnou koncentraci. Obsah vitaminu A se stanoví metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC) s UV nebo fluorescenční detekcí. Chromatografické parametry jsou vybrány tak, aby nedocházelo k separaci all-trans-vitamin-A-alkoholu a jeho cis-izomerů.

3.    Činidla

4.    Přístroje

5.    Postup

5.1.    Příprava vzorku

Vzorek se rozemele tak, aby prošel sítem s oky o velikosti 1 mm a aby během přípravy nedošlo k jeho zahřátí. Mletí musí být provedeno bezprostředně před vážením a saponifikací, jinak může dojít ke ztrátám vitaminu A. Pokud je rozdělení velikosti částic přiměřené (např. premixy a doplňkové látky), vzorek (vzorky) se nemele (nemelou).

5.2.    Saponifikace

Podle obsahu vitaminu A ve vzorku se s přesností na 1 mg naváží 2–25 g vzorku do 500 ml baňky s plochým dnem nebo kónické baňky (bod 4.2.1). V případě nízkých koncentrací lze hmotnost vzorku zvýšit, aby byl v navážce vzorku dostatek částic. Za intenzivního míchání se přidá 130 ml ethanolu (bod 3.1), přibližně 100 mg BHT (bod 3.13), 2 ml roztoku askorbátu sodného (bod 3.5) a 2 ml roztoku sulfidu sodného bod (bod 3.6). Baňka se připojí k chladiči (bod 4.3) a ponoří se do vodní lázně s magnetickou míchačkou (bod 4.7). Zahřeje se k varu a vaří se pod refluxem 5 minut. Potom se přes chladič (bod 4.3) přidá 25 ml roztoku hydroxidu draselného (bod 3.4) a vaří se pod refluxem za míchání pod pomalým proudem dusíku dalších 25 minut. Potom se chladič opláchne přibližně 20 ml vody a obsah baňky se nechá vychladnout na laboratorní teplotu.

5.3.    Extrakce

Saponifikovaný roztok se dekantací a propláchnutím celkem 250 ml vody převede kvantitativně do 1 000  ml dělicí nálevky (bod 4.2.3) nebo do extrakčního zařízení (bod 4.8). Saponifikační baňka se postupně opláchne 25 ml ethanolu (bod 3.1) a 100 ml petroletheru (bod 3.2) a oba oplachy se převedou do dělicí nálevky nebo do extrakčního zařízení. Konečný poměr vody a ethanolu v kombinovaných roztocích musí být asi 2:1. Roztok se dvě minuty intenzivně třepe a potom se nechá dvě minuty stát.

5.3.1.    Extrakce v dělicí nálevce (bod 4.2.3)

Po separaci vrstev (viz poznámka v bodě 7.3) se petroletherová vrstva převede do další dělicí nálevky (bod 4.2.3). Extrakce se opakuje dvakrát se 100 ml petroletheru (bod 3.2) a dvakrát s 50 ml petroletheru (bod 3.2).

Spojené extrakty v dělicí nálevce se dvakrát promyjí mírným kroužením (aby nevznikala emulze) 100 ml vody a potom se opakovaně protřepávají se 100 ml vody, dokud voda nezůstane po přidání roztoku fenolftaleinu (bod 3.7) bezbarvá (obvykle stačí čtyři promytí). Promytý extrakt se přefiltruje do 500 ml odměrné baňky (bod 4.2.2) přes suchý skládaný filtr pro separaci fází (bod 4.4), aby se odstranila suspendovaná voda. Dělicí nálevka a filtr se opláchne 50 ml petroletheru (bod 3.2). Baňka se petroletherem (bod 3.2) doplní po značku a důkladně promíchá.

5.3.2.    Extrakce v extrakčním zařízení (bod 4.8)

Po separaci vrstev (viz poznámka 7.3) se ze skleněného válce (bod 4.8.1) odstraní zátka a místo ní se vloží vkladatelné zařízení se skleněným zábrusem (bod 4.8.2). Spodní strana nastavitelné U-trubičky se umístí tak, aby byla právě nad rozhraním. Za použití tlaku dusíku (přiváděného postranním raménkem) se převede horní petroletherová vrstva do 1 000  ml dělicí nálevky (bod 4.2.3). Přidá se 100 ml petroletheru (bod 3.2), skleněný válec se zazátkuje a důkladně protřepe. Po separaci vrstev se horní vrstva opět převede stejným způsobem do dělicí nálevky. Extrakce se opakuje s dalšími 100 ml petroletheru (bod 3.2) a pak ještě dvakrát s 50 ml petroletheru (bod 3.2). Horní petroletherová vrstva se vždy přidá k předchozí do dělicí nálevky.

Spojené extrakty petroletheru v dělicí nálevce se promyjí, jak je popsáno v bodě 5.3.1, a postupuje se dále podle popisu v uvedeném bodě.

5.4.    Příprava roztoku vzorku pro stanovení HPLC

Alikvotní část roztoku petroletheru (podle bodu 5.3.1 nebo 5.3.2) se odpipetuje do 250 ml hruškovité baňky (bod 4.2.4). Rozpouštědlo se na rotační odparce (bod 4.1) odpaří za sníženého tlaku při teplotě vodní lázně nepřekračující 40 °C téměř do sucha. Atmosférický tlak se obnoví zavedením dusíku (bod 3.10) do baňky a ta se odpojí od rotační odparky. Zbytek rozpouštědla se odpaří pod proudem dusíku (bod 3.10) a odparek se ihned rozpustí ve známém objemu (10–100 ml) methanolu (bod 3.3) (výsledná koncentrace vitaminu A musí být v rozsahu 5–30 IU/ml).

5.5.    Stanovení pomocí HPLC

Vitamin A se separuje na koloně C18 s reverzní fází (bod 4.5.1) a jeho koncentrace se měří UV detektorem (325 nm) nebo fluorescenčním detektorem (excitace: 325 nm, emise: 475 nm) (bod 4.5.2).

Do přístroje se nastřikuje alikvotní část (např. 20 μl) methanolického roztoku získaného podle bodu 5.4 a eluuje se mobilní fází (bod 3.9). Průměrná hodnota výšek (ploch) píků se vypočte z několika opakovaných nástřiků téhož roztoku vzorku nebo kalibračních roztoků (bod 5.6.2).

Podmínky HPLC

Následující podmínky jsou doporučené; lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné výsledky.

5.6.    Kalibrace

5.6.1.    Příprava pracovních standardních roztoků

Do 500 ml baňky s plochým dnem nebo kónické baňky (bod 4.2.1) se odpipetuje 20 ml zásobního roztoku vitamin-A-acetátu (bod 3.11.1) nebo 20 ml zásobního roztoku vitamin-A-palmitátu (bod 3.12.1) a hydrolyzuje se podle bodu 5.2, ale bez přidání BHT. Potom se provede extrakce petroletherem (bod 3.2) podle bodu 5.3 a doplní se na 500 ml petroletherem (bod 3.2). 100 ml tohoto extraktu se odpaří na rotační odparce téměř do sucha (viz 5.4), zbylé rozpouštědlo se odpaří pod proudem dusíku (bod 3.10) a odparek se rozpustí v 10,0 ml methanolu (bod 3.3). Nominální koncentrace vitaminu A v roztoku je 560 IU/ml. Přesný obsah se stanoví podle bodu 5.6.3.3. Pracovní standardní roztok se připravuje před použitím čerstvý.

Do 20 ml odměrné baňky se odpipetují 2,0 ml tohoto pracovního standardního roztoku, baňka se doplní po značku methanolem (bod 3.3) a promíchá. Nominální koncentrace vitaminu A v tomto zředěném pracovním standardním roztoku je 56 IU/ml.

5.6.2.    Příprava kalibračních roztoků a kalibrační křivky

Do sady 20 ml odměrných baněk se odpipetuje postupně 1,0/2,0/5,0 a 10,0 ml zředěného pracovního standardního roztoku, doplní se methanolem (bod 3.3) po značku a promíchá. Nominální koncentrace vitaminu A v těchto roztocích jsou 2,8/5,6/14,0 a 28,0 IU/ml.

Provede se opakovaný nástřik 20 μl každého kalibračního roztoku a stanoví se průměrná hodnota výšek (ploch) píků. Z průměrných hodnot výšek (ploch) píků se sestrojí kalibrační křivka, přičemž se použijí výsledky UV kontroly (bod 5.6.3.3).

5.6.3.    UV standardizace standardních roztoků

5.6.3.1.   Zásobní roztok vitamin-A-acetátu

Do 50 ml odměrné baňky (bod 4.2.2) se odpipetují 2,0 ml zásobního roztoku vitamin-A-acetátu (bod 3.11.1) a doplní se po značku 2-propanolem (bod 3.8). Nominální koncentrace vitaminu A v roztoku je 56 IU/ml. Do 25 ml odměrné baňky se odpipetují 3,0 ml tohoto zředěného roztoku vitamin-A-acetátu a doplní se po značku 2-propanolem (bod 3.8). Nominální koncentrace vitaminu A v roztoku je 6,72 IU/ml. Na spektrofotometru (bod 4.6) se proměří UV spektrum tohoto roztoku proti 2-propanolu (bod 3.8) v rozmezí 300–400 nm. Extinkční maximum musí ležet mezi 325 a 327 nm.

Výpočet obsahu vitaminu A:

5.6.3.2.   Zásobní roztok vitamin-A-palmitátu

Do 50 ml odměrné baňky (bod 4.2.2) se odpipetují 2,0 ml zásobního roztoku vitamin-A-palmitátu (bod 3.12.1) a doplní se po značku 2-propanolem (bod 3.8). Nominální koncentrace vitaminu A v roztoku je 56 IU/ml. Do 25 ml odměrné baňky se odpipetují 3,0 ml tohoto zředěného roztoku vitamin-A-palmitátu a doplní se po značku 2-propanolem (bod 3.8). Nominální koncentrace vitaminu A v roztoku je 6,72 IU/ml. Na spektrofotometru (bod 4.6) se proměří UV spektrum tohoto roztoku proti 2-propanolu (bod 3.8) v rozmezí 300–400 nm. Extinkční maximum musí ležet mezi 325 a 327 nm.

Výpočet obsahu vitaminu A:

5.6.3.3.   Pracovní standardní roztok vitaminu A

Do 50 ml odměrné baňky (bod 4.2.2) se odpipetují 3,0 ml nezředěného pracovního standardního roztoku vitaminu A připraveného podle bodu 5.6.1 a doplní se po značku 2-propanolem (bod 3.8). Do 25 ml odměrné baňky se odpipetuje 5,0 ml tohoto roztoku a doplní se po značku 2-propanolem (bod 3.8). Nominální koncentrace vitaminu A v roztoku je 6,72 IU/ml. Na spektrofotometru (bod 4.6) se proměří UV spektrum tohoto roztoku proti 2-propanolu (bod 3.8) v rozmezí 300–400 nm. Extinkční maximum musí ležet mezi 325 a 327 nm.

Výpočet obsahu vitaminu A:

6.    Výpočet výsledků

Koncentrace vitaminu A v roztoku vzorku v IU/ml se stanoví porovnáním s kalibrační křivkou (bod 5.6.2) podle průměrných hodnot výšek (ploch) píků.

Obsah vitaminu A (w) v IU/kg vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

c

=

koncentrace vitaminu A v roztoku vzorku (bod 5.4) v IU/ml

V1

=

objem roztoku vzorku (bod 5.4) v ml

V2

=

objem alikvotní části podle bodu 5.4 v ml

m

=

hmotnost navážky vzorku v g

7.    Poznámky

Pro kontrolu toho, zda použitá metoda analýzy poskytuje spolehlivé výsledky, pokud jde o tuto specifickou matrici (mléčné krmné směsi), se provede zkouška na výtěžnost u dodatečné navážky vzorku. Pokud je výtěžnost nižší než 80 %, výsledek analýzy je třeba korigovat na výtěžnost.

8.    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.

9.    Výsledky kolaborativní studie ( 20 )

Obrázek 1

Extrakční zařízení (4.8)

B)   STANOVENÍ OBSAHU VITAMINU E

Obsah vitaminu E se stanoví takto:

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu vitaminu E v krmivech. Obsah vitaminu E se vyjadřuje jako mg DL-α-tokoferol-acetátu na kg. 1 mg DL-α-tokoferol-acetátu odpovídá 0,91 mg DL-α-tokoferolu (vitamin E).

Mez stanovitelnosti je 2 mg vitaminu E/kg. Tato mez stanovitelnosti je dosažitelná pouze s fluorescenčním detektorem. Při použití UV detektoru je mez stanovitelnosti 10 mg/kg.

2.    Princip

Vzorek se hydrolyzuje ethanolickým roztokem hydroxidu draselného a vitamin E se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se rozpustí v methanolu a, pokud je to nutné, naředí se na vhodnou koncentraci. Obsah vitaminu E se stanoví metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC) s fluorescenční nebo UV detekcí.

3.    Činidla

4.    Přístroje

5.    Postup

5.1.    Příprava vzorku

Vzorek se rozemele tak, aby prošel sítem s oky o velikosti 1 mm a aby během přípravy nedošlo k jeho zahřátí. Mletí musí být provedeno bezprostředně před vážením a saponifikací, jinak může dojít ke ztrátám vitaminu E.

5.2.    Saponifikace

Podle obsahu vitaminu E ve vzorku se s přesností na 0,01 g naváží 2–25 g vzorku do 500 ml baňky s plochým dnem nebo kónické baňky (bod 4.2.1). Za intenzivního míchání se přidá 130 ml ethanolu (bod 3.1), přibližně 100 mg BHT (bod 3.12), 2 ml roztoku askorbátu sodného bod (bod 3.5) a 2 ml roztoku sulfidu sodného (bod 3.6). Baňka se připojí k chladiči (bod 4.3) a ponoří se do vodní lázně s magnetickou míchačkou (bod 4.7). Zahřeje se k varu a vaří se pod refluxem 5 minut. Potom se přes chladič (bod 4.3) přidá 25 ml roztoku hydroxidu draselného (bod 3.4) a vaří se pod refluxem za míchání pod pomalým proudem dusíku dalších 25 minut. Potom se chladič opláchne přibližně 20 ml vody a obsah baňky se nechá vychladnout na laboratorní teplotu.

5.3.    Extrakce

Saponifikovaný roztok se dekantací a propláchnutím celkem 250 ml vody převede kvantitativně do 1 000  ml dělicí nálevky (bod 4.2.3) nebo do extrakčního zařízení (bod 4.8). Saponifikační baňka se postupně opláchne 25 ml ethanolu (bod 3.1) a 100 ml petroletheru (bod 3.2) a oba oplachy se převedou do dělicí nálevky nebo do extrakčního zařízení. Konečný poměr vody a ethanolu v kombinovaných roztocích musí být asi 2:1. Roztok se dvě minuty intenzivně třepe a potom se nechá dvě minuty stát.

5.3.1.    Extrakce v dělicí nálevce (bod 4.2.3)

Po separaci vrstev (viz poznámka v bodě 7.3) se petroletherová vrstva převede do další dělicí nálevky (bod 4.2.3). Extrakce se opakuje dvakrát se 100 ml petroletheru (bod 3.2) a dvakrát s 50 ml petroletheru (bod 3.2).

Spojené extrakty v dělicí nálevce se dvakrát promyjí mírným kroužením (aby nevznikala emulze) 100 ml vody a potom se opakovaně protřepávají se 100 ml vody, dokud voda nezůstane po přidání roztoku fenolftaleinu (bod 3.7) bezbarvá (obvykle stačí čtyři promytí). Promytý extrakt se přefiltruje do 500 ml odměrné baňky (bod 4.2.2) přes suchý skládaný filtr pro separaci fází (bod 4.4), aby se odstranila suspendovaná voda. Dělicí nálevka a filtr se opláchne 50 ml petroletheru (bod 3.2). Baňka se petroletherem (bod 3.2) doplní po značku a důkladně promíchá.

5.3.2.   Extrakce v extrakčním zařízení (bod 4.8)

Po separaci vrstev (viz poznámka v bodě 7.3) se ze skleněného válce (bod 4.8.1) odstraní zátka a místo ní se vloží vkladatelné zařízení se skleněným zábrusem (bod 4.8.2). Spodní strana nastavitelné U-trubičky se umístí tak, aby byla právě nad rozhraním. Za použití tlaku dusíku (přiváděného postranním raménkem) se převede horní petroletherová vrstva do 1 000  ml dělicí nálevky (bod 4.2.3). Přidá se 100 ml petroletheru (bod 3.2), skleněný válec se zazátkuje a důkladně protřepe. Po separaci vrstev se horní vrstva opět převede stejným způsobem do dělicí nálevky. Extrakce se opakuje s dalšími 100 ml petroletheru (bod 3.2) a pak ještě dvakrát s 50 ml petroletheru (bod 3.2). Horní petroletherová vrstva se vždy přidá k předchozí do dělicí nálevky.

Spojené extrakty petroletheru v dělicí nálevce se promyjí, jak je popsáno v bodě 5.3.1, a postupuje se dále podle popisu v uvedeném bodě.

5.4.    Příprava roztoku vzorku pro stanovení HPLC

Alikvotní část roztoku petroletheru (podle bodu 5.3.1 nebo 5.3.2) se odpipetuje do 250 ml hruškovité baňky (bod 4.2.4). Rozpouštědlo se na rotační odparce (bod 4.1) odpaří za sníženého tlaku při teplotě vodní lázně nepřekračující 40 °C téměř do sucha. Atmosférický tlak se obnoví zavedením dusíku (bod 3.9) do baňky a ta se odpojí od rotační odparky. Zbytek rozpouštědla se odpaří pod proudem dusíku (bod 3.9) a odparek se ihned rozpustí ve známém objemu (10–100 ml) methanolu (bod 3.3) (koncentrace DL-α-tokoferolu musí být v rozmezí 5 μg/ml až 30 μg/ml).

5.5.    Stanovení pomocí HPLC

Vitamin E se separuje na koloně C18 s reverzní fází (bod 4.5.1) a jeho koncentrace se měří fluorescenčním detektorem (excitace: 295 nm, emise: 330 nm) nebo UV detektorem (292 nm) (bod 4.5.2).

Do přístroje se nastřikuje alikvotní část (např. 20 μl) methanolického roztoku získaného podle bodu 5.4 a eluuje se mobilní fází (bod 3.8). Průměrná hodnota výšek (ploch) píků se vypočte z několika opakovaných nástřiků téhož roztoku vzorku nebo kalibračních roztoků (bod 5.6.2).

Podmínky HPLC

Následující podmínky jsou doporučené; lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné výsledky.

5.6.    Kalibrace (DL-α-tokoferol-acetát nebo DL-α-tokoferol)

5.6.1.    Standardní DL-α-tokoferol-acetát

5.6.1.1.   Příprava pracovního standardního roztoku

Do 500 ml baňky s plochým dnem nebo kónické baňky (bod 4.2.1) se odpipetuje 25 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferol-acetátu (bod 3.10.1) a hydrolyzuje se podle bodu 5.2. Potom se provede extrakce petroletherem (bod 3.2) podle bodu 5.3 a doplní se na 500 ml petroletherem. 25 ml tohoto extraktu se odpaří na rotační odparce téměř do sucha (viz bod 5.4), zbylé rozpouštědlo se odpaří pod proudem dusíku (bod 3.9) a odparek se rozpustí v 25,0 ml methanolu (bod 3.3). Nominální koncentrace tohoto roztoku je 45,5 μg DL-α-tokoferolu/ml, což odpovídá 50 μg DL-α-tokoferol-acetátu/ml. Pracovní standardní roztok se připravuje před použitím čerstvý.

5.6.1.2.   Příprava kalibračních roztoků a kalibrační křivky

Do sady 20 ml odměrných baněk se odpipetuje postupně 1,0/2,0/4,0 a 10,0 ml pracovního standardního roztoku, doplní se methanolem (bod 3.3) po značku a promíchá. Nominální koncentrace těchto roztoků jsou 2,5/5,0/10,0 a 25,0 μg/ml DL-α-tokoferol-acetátu, tj. 2,28/4,55/9,10 a 22,8 μg/ml DL-α-tokoferolu.

Provede se opakovaný nástřik 20 μl každého kalibračního roztoku a stanoví se průměrná hodnota výšek (ploch) píků. Z průměrných hodnot výšek (ploch) píků se sestrojí kalibrační křivka.

5.6.1.3.   UV standardizace zásobního roztoku DL-α-tokoferol-acetátu (bod 3.10.1)

Do 25,0 ml odměrné baňky se odpipetuje 5,0 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferol-acetátu (bod 3.10.1) a doplní se po značku ethanolem. Na spektrofotometru (bod 4.6) se proměří UV spektrum tohoto roztoku proti ethanolu (bod 3.1) v rozmezí 250–320 nm.

Absorpční maximum je při 284 nm:

Při tomto ředění musí být získaná hodnota extinkce 0,84–0,88.

5.6.2.    Standardní DL-α-tokoferol

5.6.2.1.   Příprava pracovního standardního roztoku

Do 50 ml odměrné baňky se odpipetují 2 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferolu (bod 3.11.1), zředí se methanolem (bod 3.3) a doplní se jím po značku. Nominální koncentrace tohoto roztoku je 40 μg DL-α-tokoferolu/ml, což odpovídá 44,0 μg DL-α-tokoferol-acetátu/ml. Pracovní standardní roztok se připravuje před použitím čerstvý.

5.6.2.2.   Příprava kalibračních roztoků a kalibrační křivky

Do sady 20 ml odměrných baněk se odpipetuje postupně 1,0/2,0/4,0 a 10,0 ml pracovního standardního roztoku, doplní se methanolem (bod 3.3) po značku a promíchá. Nominální koncentrace těchto roztoků jsou 2,0/4,0/8,0 a 20,0 μg/ml DL-α-tokoferolu, tj. 2,20/4,40/8,79 a 22,0 μg/ml DL-α-tokoferol-acetátu.

Provede se opakovaný nástřik 20 μl každého kalibračního roztoku a stanoví se průměrná hodnota výšek (ploch) píků. Z průměrných hodnot výšek (ploch) píků se sestrojí kalibrační křivka.

5.6.2.3.   UV standardizace zásobního roztoku DL-α-tokoferolu (bod 3.11.1)

Do 25,0 ml odměrné baňky se odpipetuje 2,0 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferolu (bod 3.11.1) a doplní se po značku ethanolem. Na spektrofotometru (bod 4.6) se proměří UV spektrum tohoto roztoku proti ethanolu (bod 3.1) v rozmezí 250–320 nm. Absorpční maximum je při 292 nm:

Při tomto ředění musí být získaná hodnota extinkce 0,6.

6.    Výpočet výsledků

Z průměrné výšky (plochy) píků vitaminu E v roztoku vzorku se stanoví koncentrace roztoku vzorku v μg/ml (počítáno jako DL-α-tokoferol-acetát) porovnáním s kalibrační křivkou (bod 5.6.1.2 nebo 5.6.2.2).

Obsah vitaminu E (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

c

=

koncentrace vitaminu E (jako DL-α-tokoferol-acetátu) v roztoku vzorku (bod 5.4) v μg/ml

V1

=

objem roztoku vzorku (bod 5.4) v ml

V2

=

objem alikvotní části (bod 5.4) v ml

m

=

hmotnost navážky vzorku v g

7.    Poznámky

8.   Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.

9.    Výsledky kolaborativní studie ( 22 )

Obrázek 2

Extrakční zařízení (4.8)

C)   STANOVENÍ OBSAHU STOPOVÝCH PRVKŮ ŽELEZA, MĚDI, MANGANU A ZINKU

Obsah železa, mědi, manganu a zinku se stanoví takto:

(1)    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení stopových prvků železa, mědi, manganu a zinku v krmivech ( 23 ). Meze stanovitelnosti jsou:

2.    Princip

Vzorek se převede po destrukci organické hmoty (pokud je obsažena) do roztoku kyselinou chlorovodíkovou. Prvky železo, měď, mangan a zinek se stanoví po příslušném zředění atomovou absorpční spektrofotometrií.

3.    Činidla

Úvodní poznámky

Pro přípravu činidel a analytických roztoků se použije voda, dvakrát destilovaná ve skleněném destilačním přístroji (borosilikátové nebo křemičité sklo) nebo po dvojím průchodu přes ionex, která prokazatelně neobsahuje kationty.

Činidla musí být nejméně analytické čistoty. Nepřítomnost prvků, které mají být stanoveny, musí být kontrolována slepou zkouškou. Pokud je to nutné, musí být činidla přečištěna.

Místo standardních roztoků popsaných níže mohou být použity komerční standardní roztoky za předpokladu, že mají deklarovaný obsah a před použitím byly překontrolovány.

4.    Přístroje

5.    Postup ( 24 )

5.1.    Vzorky obsahující organickou hmotu

5.1.1.    Spalování a příprava roztoku pro analýzu  ( 25 )

Popel se zvlhčí vodou a přenese se do 250 ml kádinky. Kelímek se vypláchne celkem asi 5 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.1) a další kyselina se přidává pomalu a opatrně do kádinky (může proběhnout prudká reakce v důsledku tvorby CO2). Kyselina chlorovodíková (bod 3.1) se přidává po kapkách a za míchání, dokud neustane šumění. Odpaří se do sucha za občasného zamíchání skleněnou tyčinkou.

K odparku se přidá 15 ml kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l (bod 3.2) a poté asi 120 ml vody. Promíchá se skleněnou tyčinkou, která se ponechá v kádince, a poté se kádinka zakryje hodinovým sklem. Obsah kádinky se uvede do mírného varu a udržuje se na bodu varu, dokud se popel nerozpustí. Roztok se přefiltruje přes bezpopelný filtrační papír a filtrát se jímá do 250 ml odměrné baňky. Kádinka a filtr se promyjí 5 ml horké kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l (bod 3.2) a dvakrát vroucí vodou. Odměrná baňka se doplní po značku vodou (koncentrace HCl je asi 0,5 mol/l).

Poznámky:

5.1.2.    Spektrofotometrické stanovení

5.1.2.1.   Příprava kalibračních roztoků

Pro každý stanovovaný prvek se připraví z pracovních standardních roztoků (bod 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 a 3.10.1) řada kalibračních roztoků. Kalibrační roztoky mají koncentraci HCl asi 0,5 mol/l a (v případě železa, manganu a zinku) koncentraci chloridu lanthanitého odpovídající 0,1 % La (w/v).

Koncentrace vybraných stopových prvků musí ležet v rozsahu citlivosti použitého spektrofotometru. Níže uvedené tabulky ukazují příklad složení typických řad kalibračních roztoků; v závislosti na typu a citlivosti použitého spektrofotometru však může být nutno zvolit jiné koncentrace.

5.1.2.2.   Příprava roztoku pro analýzu

Při stanovení mědi lze použít přímo roztok připravený podle bodu 5.1.1. Pokud je nutné jeho koncentraci naředit na úroveň kalibračních roztoků, odpipetuje se alikvotní část roztoku do 100 ml odměrné baňky a doplní se po značku kyselinou chlorovodíkovou 0,5 mol/l (bod 3.3).

Při stanovení železa, manganu a zinku se odpipetuje alikvotní část roztoku připraveného podle bodu 5.1.1 do 100 ml odměrné baňky, přidá se 10 ml roztoku chloridu lanthanitého (bod 3.11) a doplní se po značku kyselinou chlorovodíkovou 0,5 mol/l (bod 3.3) (viz rovněž bod 8 „Poznámka“).

5.1.2.3.   Slepá zkouška

Slepá zkouška musí zahrnovat všechny předepsané kroky postupu, ale vlastní vzorek se nepoužije. Kalibrační roztok „0“ nemůže být použit jako slepá zkouška.

5.1.2.4.   Měření atomové absorpce

Atomová absorpce kalibračních roztoků a analyzovaného roztoku se změří s použitím oxidačního plamene vzduch-acetylen při těchto vlnových délkách:

5.2.    Minerální krmiva

Pokud vzorek neobsahuje organickou hmotu, nemusí se spalovat. Příprava se provádí podle bodu 5.1.1.1 od druhého odstavce. Nemusí se provádět ani odpařování s kyselinou fluorovodíkovou.

6.    Výpočet výsledků

Koncentrace daného stopového prvku v roztoku se vypočte z kalibrační křivky a výsledek se vyjádří v miligramech stopového prvku na kilogram vzorku (ppm).

7.    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku týmž laborantem nesmí překročit:

8.    Poznámka

Přítomnost velkého množství fosfátů může ovlivňovat stanovení železa, manganu a zinku. Aby se tomuto ovlivnění zabránilo, musí být přidáván roztok chloridu lanthanitého (bod 3.11). Pokud je váhový poměr (Ca + Mg)/P ve vzorku > 2, roztok chloridu lanthanitého (bod 3.11) se do roztoku pro analýzu ani do kalibračních roztoků přidávat nemusí.

D)   STANOVENÍ OBSAHU HALOFUGINONU

DL-trans-7-brom-6-chlor-3-[3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-chinazolin-4-(3H)-on-hydrobromid

Obsah halofuginonu se stanoví takto:

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu halofuginonu v krmivech. Mez stanovitelnosti je 1 mg/kg.

2.    Princip

Obsah halofuginonu se stanoví jako volná báze po extrakci horkou vodou do ethylacetátu a následně se rozdělí jako hydrochlorid do vodného kyselého roztoku. Extrakt se přečistí na ionexové chromatografické koloně. Obsah halofuginonu se stanoví metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí.

3.    Činidla

Do 500 ml odměrné baňky se naváží 50 mg halofuginonu (bod 3.6) s přesností na 0,1 mg, rozpustí se v tlumivém roztoku octanu amonného (bod 3.18), doplní po značku tlumivým roztokem a promíchá. Tento roztok je stálý tři týdny při teplotě 5 °C, je-li skladován ve tmě.

Do sady 100 ml odměrných baněk se odpipetuje postupně 1,0/2,0/3,0/4,0 a 6,0 ml zásobního standardního roztoku (bod 3.6.1). Doplní se po značku mobilní fází (bod 3.21) a promíchá. Roztoky mají koncentrace halofuginonu 1,0/2,0/3,0/4,0 a 6,0 μg/ml. Tyto roztoky se musí připravovat před použitím čerstvé.

50 g uhličitanu sodného (bod 3.11) se rozpustí ve vodě, doplní se na 1 litr a přidává se chlorid sodný (bod 3.12) až k nasycení roztoku.

10 ml HCl (bod 3.7) se zředí vodou na 1 litr.

19,3 g octanu amonného (bod 3.3) a 30 ml kyseliny octové (bod 3.5) se rozpustí ve vodě (bod 3.14) a doplní se na jeden litr.

Přiměřené množství amberlitu (bod 3.2) se promývá ve vodě, až se odstraní všechny chloridové ionty, což se prokáže zkouškou pomocí dusičnanu stříbrného (bod 3.20) na odstraňované vodní fázi. Pak se pryskyřice promyje 50 ml methanolu (bod 3.8), který se odstraní, a pryskyřice se uloží pod čerstvý methanol.

0,17 g dusičnanu stříbrného (bod 3.9) se rozpustí v 10 ml vody.

Smíchá se 500 ml acetonitrilu (bod 3.1), 300 ml tlumivého roztoku octanu amonného (bod 3.18) a 1 200  ml vody (bod 3.14). pH se upraví na 4,3 kyselinou octovou (bod 3.5). Přefiltruje se 0,22μm filtrem (bod 4.8) a roztok se odplyní (např. tím, že se vystaví ultrazvuku po dobu 10 minut). Tento roztok je stálý jeden měsíc, je-li skladován ve tmě a v uzavřené nádobě.

4.    Přístroje

5.    Postup

5.1.    Obecně

5.2.    Extrakce

Do odstředivkové zkumavky o objemu 200 ml se naváží 10 g připraveného vzorku s přesností na 0,1 g, přidá se 0,5 g askorbátu sodného (bod 3.10), 0,5 g EDTA (bod 3.13) a 20 ml vody a promíchá se. Zkumavka se umístí na pět minut do vodní lázně (80 °C). Po vychladnutí na laboratorní teplotu se přidá 20 ml roztoku uhličitanu sodného (bod 3.15) a promíchá se. Ihned se přidá 100 ml ethylacetátu (bod 3.4) a ručně se 15 sekund intenzivně třepe. Pak se zkumavka s uvolněnou zátkou umístí na tři minuty do ultrazvukové lázně (bod 4.1). Odstředí se dvě minuty a ethylacetátová fáze se odlije přes filtr ze skleněných vláken (bod 4.6) do 500 ml dělicí nálevky. Extrakce vzorku se opakuje s dalšími 100 ml ethylacetátu. Kombinované extrakty se promývají jednu minutu 50 ml roztoku uhličitanu sodného saturovaného chloridem sodným (bod 3.16) a poté se vodná vrstva odstraní.

Organická vrstva se extrahuje po dobu jedné minuty 50 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.17). Spodní kyselinová vrstva se vypustí do 250 ml dělicí nálevky. Organická vrstva se znovu extrahuje po dobu 1,5 minuty dalšími 50 ml kyseliny chlorovodíkové a kyselinová vrstva se spojí s prvním extraktem. Spojené kyselinové extrakty se třepou přibližně 10 sekund s 10 ml ethylacetátu (bod 3.4).

Vodná vrstva se kvantitativně převede do 250 ml baňky s kulatým dnem a organická fáze se odstraní. Pomocí rotační filmové odparky (bod 4.2) se z kyselého roztoku odpaří všechen zbývající ethylacetát. Teplota vodní lázně nesmí přesáhnout 40 °C. Ve vakuu přibližně 25 mbar se všechen zbývající ethylacetát odstraní během pěti minut při teplotě 38 °C.

5.3.    Přečištění

5.3.1.    Příprava amberlitové kolony

Pro každý extrakt vzorku se připraví kolona s XAD-2. Do skleněné kolony (bod 4.5) se přenese 10 g připraveného amberlitu (bod 3.19) spolu s methanolem (bod 3.8). Na horní konec pryskyřicové kolony se vloží malá zátka ze skelné vaty. Methanol z kolony se odstraní a kolona se promyje 100 ml vody. Přívod vody se zastaví, jakmile kapalina dosáhne horního konce pryskyřicové kolony. Před použitím se kolona nechá 10 minut ekvilibrovat. Kolona nesmí nikdy vyschnout.

5.3.2.    Přečištění vzorku

Extrakt (bod 5.2) se kvantitativně převede na horní část připravené amberlitové kolony (bod 5.3.1) a eluuje se, přičemž se eluát odstraňuje. Rychlost eluce nesmí přesáhnout 20 ml/min. Baňka s kulatým dnem se vypláchne 20 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.17) a tato kapalina se použije k promytí pryskyřicové kolony. Zbytek kyselého roztoku se z kolony odstraní proudem vzduchu. Promývací roztok se také odstraní. Na kolonu se přidá 100 ml methanolu (bod 3.8) a vypustí se asi 5–10 ml eluátu do 250 ml baňky s kulatým dnem. Zbývající methanol se nechá 10 minut ustát na koloně a potom se pokračuje v eluci rychlostí, která nepřesáhne 20 ml/min. Eluát se vypustí do téže baňky s kulatým dnem. Methanol se odpaří na rotační filmové odparce (bod 4.2), teplota vodní lázně nesmí přesáhnout 40 °C. Odparek se pomocí mobilní fáze (bod 3.21) kvantitativně převede do 10 ml odměrné baňky. Doplní se mobilní fází po značku a promíchá. Alikvotní část se filtruje membránovým filtrem (bod 4.7). Tento roztok se uschová pro stanovení HPLC (bod 5.4).

5.4.    Stanovení HPLC

5.4.1.    Parametry

Následující podmínky jsou doporučené, lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné výsledky.

Stálost chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (bod 3.6.2), který obsahuje 3,0 μg/ml halofuginonu, dokud se nedosáhne konstantních výšek (nebo ploch) píků a konstantních retenčních časů.

5.4.2.    Kalibrační křivka

Provede se opakovaný nástřik každého kalibračního roztoku (bod 3.6.2) a změří se výšky (plochy) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek nebo ploch píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

5.4.3.    Roztok vzorku

Provede se opakovaný nástřik roztoku vzorku (bod 5.3.2) při použití stejného objemu jako u kalibračních roztoků a stanoví se průměrná hodnota výšky (plochy) píků halofuginonu.

6.    Výpočet výsledků

Koncentrace halofuginonu v roztoku vzorku v μg/ml se stanoví podle průměrné hodnoty výšky (plochy) halofuginonových píků v roztoku vzorku porovnáním s kalibrační křivkou (bod 5.4.2).

Obsah halofuginonu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

c

:

koncentrace halofuginonu v roztoku vzorku v μg/ml,

m

:

hmotnost navážky vzorku v g.

7.    Ověření výsledků

7.1.    Identita

Identitu analytu lze potvrdit simultánní chromatografií nebo využitím detektoru s diodovým polem, přičemž se porovnávají spektra extraktu vzorku a kalibračního roztoku (bod 3.6.2) obsahujícího 6,0 μg/ml.

7.1.1.    Simultánní chromatografie

Extrakt vzorku se obohatí přidáním vhodného množství kalibračního roztoku (bod 3.6.2). Množství přidaného halofuginonu musí odpovídat odhadovanému obsahu halofuginonu v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku halofuginonu, a to úměrně k přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině maximální výšky se smí odchylovat od šířky původního píku nejvýše o ± 10 %.

7.1.2.    Detektor s diodovým polem

Výsledky jsou posuzovány podle těchto kritérií:

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

7.2.    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit 0,5 mg/kg při obsahu halofuginonu do 3 mg/kg.

7.3.    Výtěžnost

Výtěžnost u obohaceného slepého vzorku musí činit nejméně 80 %.

8.    Výsledky kolaborativní studie

Byla provedena kolaborativní studie ( 26 ), během níž byly zkoušeny tři vzorky osmi laboratořemi.

E)   STANOVENÍ OBSAHU ROBENIDINU

1,3-bis[(4-chlorbenzyliden)amino]guanidin-hydrochlorid

Obsah robenidinu se stanoví takto:

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu robenidinu v krmivech. Mez stanovitelnosti je 5 mg/kg.

2.    Princip

Vzorek se extrahuje okyseleným methanolem. Extrakt se vysuší a jeho alikvotní část se přečistí na koloně s oxidem hlinitým. Robenidin se eluuje z kolony methanolem, koncentruje se a na vhodný objem se upraví pomocí mobilní fáze. Obsah robenidinu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí.

3.    Činidla

Do 500 ml odměrné baňky se odměří 4,0 ml kyseliny chlorovodíkové (ρ20 = 1,18 g/ml), doplní se po značku methanolem (bod 3.1) a promíchá. Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Typ 3 A, 8–12 mesh (1,6–2,5 mm perličky krystalického hlinitokřemičitanu, průměr pórů 0,3 mm).

100 g oxidu hlinitého se naváží do vhodné nádoby a přidají se 2,0 ml vody. Zazátkuje se a protřepává přibližně 20 minut. Skladuje se v dobře zazátkované nádobě.

3,40 g dihydrogenfosforečnanu draselného se rozpustí ve vodě (pro HPLC) v 1 000  ml odměrné baňce, doplní se po značku a promíchá.

3,55 g bezvodého (nebo 4,45 g dihydrátu, nebo 8,95 g dodekahydrátu) hydrogenfosforečnanu sodného se rozpustí ve vodě (pro HPLC) v 1 000  ml odměrné baňce, doplní se po značku a promíchá.

Smíchá se:

Přefiltruje se 0,22μm filtrem (bod 4.6) a roztok se odplyní (např. ultrazvukem po dobu 10 minut).

Čistý robenidin: 1,3-bis[(4-chlorbenzyliden)amino]guanidin-hydrochlorid.

Naváží se 30 mg standardní látky robenidinu (bod 3.9) s přesností na 0,1 mg. Rozpustí se v okyseleném methanolu (bod 3.2) ve 100 ml odměrné baňce, doplní se po značku týmž rozpouštědlem a promíchá se. Baňka se obalí aluminiovou fólií a uloží ve tmě.

Odměří se 10,0 ml zásobního standardního roztoku (bod 3.9.1) do 250 ml odměrné baňky, doplní se po značku mobilní fází (bod 3.8) a promíchá. Baňka se obalí aluminiovou fólií a uloží ve tmě.

Do sady 50 ml odměrných baněk se odpipetuje postupně 5,0/10,0/15,0/20,0 a 25,0 ml pracovního standardního roztoku (bod 3.9.2). Doplní se po značku mobilní fází (bod 3.8) a promíchá. Tyto roztoky odpovídají 1,2/2,4/3,6/4,8 a 6,0 μg/ml robenidinu. Tyto roztoky se musí připravovat před použitím čerstvé.

4.    Přístroje

Vyrobená z tmavého skla, opatřená uzavíracím ventilem a nádržkou o obsahu přibližně 150 ml. Vnitřní průměr 10–15 mm, délka 250 mm.

5.    Postup

5.1.    Obecně

5.2.    Extrakce

Do 250 ml kónické baňky se naváží přibližně 15 g připraveného vzorku s přesností na 0,01 g, přidá se 100,0 ml okyseleného methanolu (bod 3.2), zazátkuje a hodinu třepe na třepačce (bod 4.2). Roztok se přefiltruje přes filtrační papír ze skleněných vláken (bod 4.5) a celý objem filtrátu se jímá do 150 ml kónické baňky. Přidá se 7,5 g molekulárního síta (bod 3.4), zazátkuje a pět minut se třepe. Potom se ihned přefiltruje přes filtrační papír ze skleněných vláken. Tento roztok se použije k čištění (bod 5.3).

5.3.    Čištění

5.3.1.    Příprava kolony s oxidem hlinitým

Do spodního konce skleněné kolony (bod 4.1) se vloží malá zátka ze skelné vaty a utěsní se skleněnou tyčinkou. Naváží se 11,0 g připraveného oxidu hlinitého (bod 3.5) a nasype se do kolony, pokud možno s minimální časovou prodlevou v okolním prostředí. Oxid hlinitý se v naplněné koloně setřese lehkým poklepem na spodní konec kolony.

5.3.2.    Čištění vzorku

Na kolonu se napipetuje 5,0 ml připraveného extraktu vzorku (bod 5.2). Špička pipety se opře o stěnu kolony a roztok se nechá absorbovat oxidem hlinitým. Robenidin se z kolony eluuje pomocí 100 ml methanolu (bod 3.1) při rychlosti průtoku 2–3 ml za minutu a eluát se jímá do 250 ml baňky s kulatým dnem. Roztok methanolu se za redukovaného tlaku a při teplotě 40 °C odpaří do sucha v rotační filmové odparce (bod 4.3). Odparek se znovu rozpustí ve 3–4 ml mobilní fáze (bod 3.8) a kvantitativně se převede do 10 ml odměrné baňky. Baňka se několikrát vypláchne 1–2 ml mobilní fáze a tyto roztoky se přidají do odměrné baňky. Baňka se doplní po značku týmž rozpouštědlem a promíchá. Alikvotní část se přefiltruje přes 0,45μm membránový filtr (bod 4.7). Tento roztok se použije pro stanovení HPLC (bod 5.4).

5.4.    Stanovení HPLC

5.4.1.    Parametry

Následující podmínky jsou doporučené, lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné výsledky:

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (bod 3.9.3), který obsahuje 3,6 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek píků a konstantních retenčních časů.

5.4.2.    Kalibrační křivka

Provede se opakovaný nástřik každého kalibračního roztoku (bod 3.9.3) a změří se výšky (plochy) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek nebo ploch píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

5.4.3.    Roztok vzorku

Provede se opakovaný nástřik extraktu vzorku (bod 5.3.2) při použití stejného objemu jako u kalibračních roztoků a stanoví se průměrná hodnota výšky (plochy) píků robenidinu.

6.    Výpočet výsledků

Z průměrných hodnot výšky (plochy) robenidinových píků v roztoku vzorku se určí koncentrace robenidinu v roztoku vzorku v μg/ml porovnáním s kalibrační křivkou (bod 5.4.2).

Obsah robenidinu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

c

=

koncentrace robenidinu v roztoku vzorku v μg/ml,

m

=

hmotnost navážky vzorku v g.

7.    Ověření výsledků

7.1.    Identita

Identitu analytu lze potvrdit simultánní chromatografií nebo využitím detektoru s diodovým polem, přičemž se porovnávají spektra extraktu vzorku a kalibračního roztoku (bod 3.9.3) obsahujícího 6 μg/ml.

7.1.1.    Simultánní chromatografie

Extrakt vzorku je obohacen přidáním vhodného množství kalibračního roztoku (bod 3.9.3). Množství přidaného robenidinu musí odpovídat odhadovanému obsahu robenidinu v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku robenidinu, a to úměrně k přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině maximální výšky se smí odchylovat od šířky původního píku nejvýše o ± 10 %.

7.1.2.    Detektor s diodovým polem

Výsledky jsou posuzovány podle těchto kritérií:

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

7.2.    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí přesáhnout 10 % z vyššího výsledku u obsahu robenidinu nad 15 mg/kg.

7.3.    Výtěžnost

Výtěžnost u obohaceného slepého vzorku musí činit nejméně 85 %.

8.    Výsledky kolaborativní studie

V EU byla provedena kolaborativní studie, během níž dvanáct laboratoří analyzovalo čtyři vzorky krmiv pro drůbež a králíky ve formě moučky nebo v peletované formě. U každého vzorku byla provedena opakovaná analýza. Výsledky jsou uvedeny v této tabulce:

F)   STANOVENÍ OBSAHU DIKLAZURILU

2,6-dichlor-alfa-(4-chlorfenyl)-4-(4,5-dihydro–3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-(3H)yl)benzenacetonitril

Obsah diklazurilu se stanoví takto:

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu diklazurilu v krmných směsích a premixech ( 27 ). Mez detekce je 0,1 mg/kg, mez stanovitelnosti 0,5 mg/kg. Nižší meze stanovitelnosti jsou dosažitelné, ale uživatel je musí validovat.

2.    Princip

Po přidání vnitřního standardu se vzorek extrahuje okyseleným methanolem. U krmiv se alikvotní část extraktu přečistí na SPE patroně C18. Diklazuril se z patrony eluuje směsí okyseleného methanolu a vody. Po odpaření se zbytek rozpustí v roztoku DMF/voda. U premixů se extrakt odpaří a zbytek se rozpustí v roztoku DMF/voda. Obsah diklazurilu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s ternárním gradientem a UV detekcí.

3.    Činidla

Do 50 ml odměrné baňky se naváží 25 mg diklazurilu (bod 3.8) s přesností na 0,1 mg, rozpustí se v DMF (bod 3.6), doplní se DMF (bod 3.6) po značku a promíchá. Odměrná baňka se obalí hliníkovou fólií nebo se použije odměrná baňka z tmavého skla a uchovává se v chladničce. Roztok je při teplotě ≤ 4 °C stálý jeden měsíc ( 28 ).

Do 50 ml odměrné baňky se převede 5,00 ml zásobního standardního roztoku (bod 3.8.1), doplní se DMF (bod 3.6) po značku a promíchá. Odměrná baňka se obalí hliníkovou fólií nebo se použije odměrná baňka z tmavého skla a uchovává se v chladničce. Roztok je při teplotě ≤ 4 °C stálý jeden měsíc.

Do 50 ml odměrné baňky se naváží 25 mg vnitřního standardu (bod 3.9) s přesností na 0,1 mg, rozpustí se v DMF (bod 3.6), doplní se DMF (bod 3.6) po značku a promíchá. Odměrná baňka se obalí hliníkovou fólií nebo se použije odměrná baňka z tmavého skla a uchovává se v chladničce. Roztok je při teplotě ≤ 4 °C stálý jeden měsíc.

Do 50 ml odměrné baňky se převede 5,00 ml zásobního roztoku vnitřního standardu (bod 3.9.1), doplní se DMF (bod 3.6) po značku a promíchá. Odměrná baňka se obalí hliníkovou fólií nebo se použije odměrná baňka z tmavého skla a uchovává se v chladničce. Roztok je při teplotě ≤ 4 °C stálý jeden měsíc.

Do 100 ml odměrné baňky se naváží p/10 mg vnitřního standardu s přesností na 0,1 mg, rozpustí se v DMF (bod 3.6) v ultrazvukové lázni (bod 4.7), doplní DMF po značku a promíchá. Odměrná baňka se obalí hliníkovou fólií nebo se použije odměrná baňka z tmavého skla a uchovává se v chladničce. Roztok je při teplotě ≤ 4 °C stálý jeden měsíc.

Do 50 ml odměrné baňky se odpipetuje 1,00 ml standardního roztoku diklazurilu (bod 3.8.2) a 2,00 ml roztoku vnitřního standardu (bod 3.9.2). Přidá se 17 ml DMF (bod 3.6), doplní se vodou (bod 3.1) po značku a promíchá. Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Do 50 ml odměrné baňky se odpipetují 2,00 ml standardního roztoku diklazurilu (bod 3.8.2) a 2,00 ml roztoku vnitřního standardu (bod 3.9.2). Přidá se 16 ml DMF (bod 3.6), doplní se vodou (bod 3.1) po značku a promíchá. Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Do 50 ml odměrné baňky se odpipetují 3,00 ml standardního roztoku diklazurilu (bod 3.8.2) a 2,00 ml roztoku vnitřního standardu (bod 3.9.2). Přidá se 15 ml DMF (bod 3.6), doplní se vodou (bod 3.1) po značku a promíchá. Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Do 50 ml odměrné baňky se odpipetují 4,00 ml standardního roztoku diklazurilu (bod 3.8.2) a 2,00 ml roztoku vnitřního standardu (bod 3.9.2). Přidá se 14 ml DMF (bod 3.6), doplní se vodou (bod 3.1) po značku a promíchá. Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Do 50 ml odměrné baňky se odpipetuje 5,00 ml standardního roztoku diklazurilu (bod 3.8.2) a 2,00 ml roztoku vnitřního standardu (bod 3.9.2). Přidá se 13 ml DMF (bod 3.6), doplní se vodou (bod 3.1) po značku a promíchá. Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Do 1 000  ml methanolu (bod 3.5) se napipetuje 5,0 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.7) a promíchá.

5 g octanu amonného (bod 3.2) a 3,4 g TBHS (bod 3.3) se rozpustí v 1 000  ml vody (bod 3.1) a promíchá se.

4.    Přístroje

5.    Postup

5.1.    Obecně

5.1.1.    Slepý vzorek krmiva

Provede se analýza pro kontrolu toho, že slepý vzorek krmiva neobsahuje ani diklazuril, ani jiné rušivé látky. Slepý vzorek krmiva musí mít podobné složení jako vzorek a při analýze nesmí být zjištěn diklazuril ani jiné rušivé látky.

5.1.2.    Zkouška na výtěžnost

Provede se zkouška na výtěžnost u slepého vzorku krmiva, který byl obohacen přidáním takového množství diklazurilu, které odpovídá jeho obsahu ve vzorku. Pro obohacení na obsah 1 mg/kg se k 50 g slepého vzorku krmiva přidá 0,1 ml zásobního standardního roztoku (bod 3.8.1). Důkladně se promíchá a vyčká 10 minut, znovu se několikrát promíchá a potom se se může začít s extrakcí (bod 5.2).

Není-li k dispozici slepý vzorek krmiva podobného složení jako vzorek (viz bod 5.1.1), lze provést zkoušku na výtěžnost metodou standardního přídavku. V tom případě se vzorek, jenž má být analyzován, obohatí přidáním takového množství diklazurilu, které odpovídá jeho obsahu ve vzorku. Obohacený vzorek se potom zkouší společně se vzorkem neobohaceným a výtěžnost se vypočte odečtením.

5.2.    Extrakce

5.2.1.    Krmné směsi

Do 500 ml kónické baňky se naváží přibližně 50 g vzorku s přesností na 0,01 g. Přidá se 1,00 ml roztoku vnitřního standardu (bod 3.9.2) a 200 ml extrakčního rozpouštědla (bod 3.12) a baňka se zazátkuje. Směs se přes noc třepe na třepačce (bod 4.1). Poté se nechá 10 minut usadit. 20 ml supernatantu se převede do vhodné skleněné nádoby a zředí se 20 ml vody (bod 3.1). Tento roztok se nanese na extrakční patronu (bod 3.11) a prosaje se pomocí vakua (bod 4.6). Patrona se promyje 25 ml směsi složené z extrakčního rozpouštědla (bod 3.12) a vody (bod 3.1), 65 + 35 (V + V). Spojené frakce se odstraní a složky se eluují 25 ml směsi složené z extrakčního rozpouštědla (bod 3.12) a vody, 80 + 20 (V + V). Tato frakce se v rotační odparce (bod 4.3) odpaří při 60 °C do sucha. Odparek se rozpustí v 1,0 ml DMF (bod 3.6), přidá se 1,5 ml vody (bod 3.1) a promíchá. Přefiltruje se přes membránový filtr (bod 4.4), který je připevněn k jednorázové injekční stříkačce (bod 4.5). Dále se pokračuje se stanovením HPLC (bod 5.3).

5.2.2.    Premixy

Do 500 ml kónické baňky se naváží přibližně 1 g vzorku s přesností na 0,001 g. Přidá se 1,00 ml roztoku vnitřního standardu (bod 3.9.3) a 200 ml extrakčního rozpouštědla (bod 3.12) a baňka se zazátkuje. Směs se přes noc třepe na třepačce (bod 4.1). Poté se nechá 10 minut usadit. 10 000 /p ml (p = nominální obsah diklazurilu v premixu v mg/kg) supernatantu se převede do baňky s kulatým dnem vhodné velikosti. V rotační odparce (bod 4.3) se odpaří za sníženého tlaku při 60 °C do sucha. Odparek se rozpustí v 10,0 ml DMF (bod 3.6), přidá se 15,0 ml vody (bod 3.1) a promíchá. Dále se pokračuje se stanovením HPLC (bod 5.3).

5.3.    Stanovení HPLC

5.3.1.    Parametry

Následující podmínky jsou doporučené, lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné nebo lepší výsledky.

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (bod 3.10.2), který obsahuje 2 μg/ml diklazurilu, a vnitřního standardu, dokud se nedosáhne konstantních výšek píků a konstantních retenčních časů.

5.3.2.    Chromatografická analýza kalibračních roztoků

Dvakrát se nastříkne 20 μl kalibračních roztoků (bod 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 a 3.10.5), stanoví se a integrují píky diklazurilu a vnitřního standardu a sestrojí se kalibrační křivka na základě poměru průměrné hodnoty výšky (plochy) píku diklazurilu k průměrné hodnotě výšky (plochy) píku vnitřního standardu vůči koncentraci diklazurilu v kalibračních roztocích (μg/ml).

5.3.3.    Chromatografická analýza roztoků vzorku

Dvakrát se nastříkne 20 μl roztoku vzorku (bod 5.2.1 nebo 5.2.2) a stanoví se průměrná hodnota výšky (plochy) píku diklazurilu a vnitřního standardu.

6.    Výpočet výsledků

6.1.    Krmné směsi

Obsah diklazurilu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

nebo

kde:

6.2.    Premixy

Obsah diklazurilu (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

 

 p nebo

 

 p

kde:

7.    Ověření výsledků

7.1.    Identita

Identitu analytu lze potvrdit simultánní chromatografií nebo využitím detektoru s diodovým polem, přičemž se porovnávají spektra extraktu vzorku (bod 5.2.1 nebo 5.2.2) a kalibračního roztoku (bod 3.10.2).

7.1.1.    Simultánní chromatografie

Extrakt vzorku (bod 5.2.1 nebo 5.2.2) je obohacen přidáním vhodného množství kalibračního roztoku (bod 3.10.2). Přidané množství diklazurilu musí odpovídat obsahu diklazurilu v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku diklazurilu a píku vnitřního standardu, a to úměrně přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině výšky se smí odchylovat od šířky původního píku diklazurilu nebo píku interního standardu v neobohaceném extraktu vzorku nejvýše o ± 10 %.

7.1.2.    Detektor s diodovým polem

Výsledky jsou posuzovány podle těchto kritérií:

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

7.2.    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou nezávislých měření provedených u dvou podvzorků nesmí překročit:

7.3.    Výtěžnost

Výtěžnost u obohaceného (slepého) vzorku musí činit nejméně 80 %.

8.    Výsledky kolaborativní studie

Byly provedeny dvě kolaborativní studie. V první studii provedené jinou skupinou laboratoří v roce 1994 byly analyzovanými vzorky dva premixy (O 100, A 100) a tři vzorky doplňkového krmiva pro drůbež (L1, Z1, K1). Jeden vzorek premixu byl smísen s organickou matricí (O 100) a druhý s anorganickou matricí (A 100). Teoretický obsah diklazurilu je 100 mg/kg. Laboratoře byly pověřeny, aby každý ze vzorků podrobily jedné nebo dvěma analýzám. (Podrobnější údaje o první kolaborativní studii viz Journal of AOAC International, svazek 77, č. 6, 1994, s. 1359–1361).

Ve druhé kolaborativní studii byly analyzovány tři krmné směsi pro drůbež obsahující diklazuril v koncentracích 0,9 mg/kg (MAT 1) a 1,5 mg/kg (MAT 2) a slepý vzorek krmiva (MAT 3). Podrobné údaje o druhé studii viz Technická zpráva Společného výzkumného střediska (2016) a Journal of AOAC International, svazek 102, č. 2, 2019, s. 646–652. Výsledky obou kolaborativních studií jsou uvedeny v následující tabulce.

9.    Obecné poznámky

Musí být předem prokázáno, že odezva diklazurilu je měřena v lineární oblasti koncentrace.

Alespoň pro analýzu diklazurilu v krmných směsích s vysokým obsahem tuku (pro tento účel vyšším než 12 % tuku) lze tuto metodu analýzy nahradit jinými metodami založenými na HPLC, např. vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s hmotnostní spektrometrií (HPLC-MS), pokud má tato alternativní metoda rovnocenné charakteristiky účinnosti (výtěžnost, preciznost za podmínek opakovatelnosti a reprodukovatelnosti).

G)   STANOVENÍ OBSAHU LASALOCIDU SODNÉHO

Sodná sůl polyetherové karboxylové kyseliny produkované Streptomyces lasaliensis.

Obsah lasalocidu sodného se stanoví takto:

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu lasalocidu sodného v krmivech. Mez detekce je 5 mg/kg, mez stanovitelnosti 10 mg/kg.

2.    Princip

Lasalocid sodný se extrahuje ze vzorku okyseleným methanolem a stanoví se vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s použitím spektrofluorimetrického (fluorescenčního) detektoru.

3.    Činidla

23,5 ml kyseliny fosforečné (bod 3.2) se doplní vodou na 100 ml.

V 500 ml vody (bod 3.11) se rozpustí 1,36 g KH2PO4 (bod 3.1), přidá se 3,5 ml kyseliny fosforečné (bod 3.2) a 10,0 ml 6-methyl-2-heptylaminu (bod 3.4). pH se upraví na 4,0 roztokem kyseliny fosforečné (bod 3.3) a doplní se vodou (bod 3.11) na 1 000  ml.

Do 1 000  ml odměrné baňky se odměří 5,0 ml kyseliny chlorovodíkové (bod 3.6), doplní se methanolem (bod 3.5) po značku a promíchá. Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Smíchá se 5 ml fosfátového tlumivého roztoku (bod 3.7) a 95 ml methanolu (bod 3.5).

Do 100 ml odměrné baňky se naváží 50 mg lasalocidu sodného (bod 3.10) s přesností na 0,1 mg a rozpustí se v okyseleném methanolu (bod 3.8), doplní se jím po značku a promíchá. Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Do 100 ml odměrné baňky se odpipetuje 10,0 ml zásobního standardního roztoku (bod 3.10.1), doplní se po značku okyseleným methanolem (bod 3.8) a promíchá. Tento roztok se musí připravovat před použitím čerstvý.

Do sady 50 ml odměrných baněk se odpipetuje postupně 1,0/2,0/4,0/5,0 a 10,0 ml pracovního standardního roztoku (bod 3.10.2). Doplní se po značku okyseleným methanolem (bod 3.8) a promíchá. Tyto roztoky odpovídají 1,0/2,0/4,0/5,0 a 10,0 μg lasalocidu sodného na ml. Tyto roztoky se musí připravovat před použitím čerstvé.

4.    Přístroje

5.    Postup

5.1.    Obecně

5.1.1.    Slepý vzorek krmiva

Pro provedení zkoušky na výtěžnost (bod 5.1.2) se provede analýza pro kontrolu toho, že slepý vzorek krmiva neobsahuje ani lasalocid sodný, ani jiné rušivé látky. Slepý vzorek krmiva musí mít podobné složení jako vzorek a nesmí být zjištěn lasalocid sodný ani jiné rušivé látky.

5.1.2.    Zkouška na výtěžnost

Provede se zkouška na výtěžnost u slepého vzorku krmiva, který byl obohacen přidáním takového množství lasalocidu sodného, které odpovídá jeho obsahu ve vzorku. Pro obohacení na obsah 100 mg/kg se převede 10,0 ml zásobního standardního roztoku (bod 3.10.1) do 250 ml kónické baňky a roztok se odpaří na objem přibližně 0,5 ml. Přidá se 50 g slepého vzorku krmiva. Důkladně se promíchá a vyčká 10 minut, znovu se několikrát promíchá a potom se se může začít s extrakcí (bod 5.2).

Není-li k dispozici slepý vzorek krmiva podobného složení jako vzorek (viz 5.1.1), lze provést zkoušku na výtěžnost metodou standardního přídavku. V tom případě se vzorek, jenž má být analyzován, obohatí přidáním takového množství lasalocidu sodného, které odpovídá jeho obsahu ve vzorku. Tento vzorek se potom zkouší společně se vzorkem neobohaceným a výtěžnost se vypočte odečtením.

5.2.    Extrakce

5.2.1.    Krmiva

Do 250 ml kónické baňky se zátkou se naváží 5–10 g vzorku s přesností na 0,01 g. Pipetou se přidá 100,0 ml okyseleného methanolu (bod 3.8). Baňka se volně uzavře zátkou a promíchá kroužením. Potom se vloží na 20 minut do ultrazvukové lázně (bod 4.1) při teplotě přibližně 40 °C. Pak se baňka vyjme a ochladí na laboratorní teplotu. Nechá se stát asi jednu hodinu, aby se usadily suspendované částice, a potom se alikvotní část přefiltruje přes 0,45μm membránový filtr (4.2) do vhodné nádoby. Dále se pokračuje se stanovením HPLC (bod 5.3).

5.2.2.    Premixy

Do 250 ml odměrné baňky se naváží asi 2 g nemletého vzorku premixu s přesností na 0,001 g. Přidá se 100,0 ml okyseleného methanolu (bod 3.8) a promíchá kroužením. Potom se vloží na 20 minut do ultrazvukové lázně (bod 4.1) při teplotě přibližně 40 °C. Pak se baňka vyjme a ochladí na laboratorní teplotu. Doplní se po značku okyseleným methanolem (bod 3.8) a důkladně promíchá. Nechá se stát asi jednu hodinu, aby se usadily suspendované částice, a potom se alikvotní část přefiltruje přes 0,45μm membránový filtr (bod 4.2). Vhodný objem čirého filtrátu se naředí okyseleným methanolem (bod 3.8) na konečnou koncentraci asi 4 μg/ml lasalocidu sodného. Dále se pokračuje se stanovením HPLC (bod 5.3).

5.3.    Stanovení HPLC

5.3.1.    Parametry

Následující podmínky jsou doporučené; lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné výsledky:

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (bod 3.10.3), který obsahuje 4,0 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek (nebo ploch) píků a konstantních retenčních časů.

5.3.2.    Kalibrační křivka

Provede se opakovaný nástřik každého kalibračního roztoku (bod 3.10.3) a stanoví se průměrná hodnota výšek (ploch) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek (ploch) píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

5.3.3.    Roztok vzorku

Provede se opakovaný nástřik extraktů vzorků získaných podle bodů 5.2.1 nebo 5.2.2 při použití stejného objemu jako u kalibračního roztoku a stanoví se průměrná hodnota výšek (ploch) píků lasalocidu sodného.

6.    Výpočet výsledků

Z průměrné hodnoty výšky (plochy) píku získané nástřikem roztoku vzorku (bod 5.3.3) se porovnáním s kalibrační křivkou stanoví koncentrace lasalocidu sodného v μg/ml.

6.1.    Krmiva

Obsah lasalocidu sodného (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

c

=

koncentrace lasalocidu sodného v roztoku vzorku (bod 5.2.1) v μg/ml

V1

=

objem extraktu vzorku podle bodu 5.2.1 v ml (tj. 100 ml)

m

=

hmotnost navážky vzorku v g

6.2.    Premixy

Obsah lasalocidu sodného (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

c

=

koncentrace lasalocidu sodného v roztoku vzorku (bod 5.2.2) v μg/ml

V2

=

objem extraktu vzorku podle bodu 5.2.2 v ml (tj. 250 ml)

f

=

faktor ředění podle bodu 5.2.2

m

=

hmotnost navážky vzorku v g

7.    Ověření výsledků

7.1.    Identita

Metody založené na spektrofluorimetrické detekci jsou méně náchylné na interference než metody s UV detekcí. Identitu analytu lze potvrdit simultánní chromatografií.

7.1.1.    Simultánní chromatografie

Extrakt vzorku (bod 5.2.1 nebo 5.2.2) je obohacen přidáním vhodného množství kalibračního roztoku (bod 3.10.3). Přidané množství lasalocidu sodného musí odpovídat obsahu lasalocidu sodného v extraktu vzorku. Přídavek se projeví pouze zvýšením píku lasalocidu sodného, a to úměrně k přidanému množství lasalocidu sodného a ředění extraktu. Šířka píku v polovině výšky se smí odchylovat od šířky původního píku v neobohaceném extraktu vzorku nejvýše o ± 10 %.

7.2.    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit:

7.3.    Výtěžnost

Pro obohacený (slepý) vzorek krmiva činí výtěžnost nejméně 80 %. Pro obohacené vzorky premixů činí výtěžnost nejméně 90 %.

8.    Výsledky kolaborativní studie

Byla provedena kolaborativní studie () , během níž dvanáct laboratoří analyzovalo dva premixy (vzorky 1 a 2) a pět krmiv (vzorky 3–7). U každého vzorku byla provedena opakovaná analýza. Výsledky jsou uvedeny v této tabulce:

H)   STANOVENÍ OBSAHU AMPROLIA HYDROCHLORIDU

1-[(4-amino-2-propyl-5-pyrimidinyl)methyl]-2-methylpyridinium chlorid monohydrochlorid

1.    Účel a oblast použití

Tato metoda umožňuje stanovení obsahu amprolia v krmivech. Mez detekce je 1 mg/kg, mez stanovitelnosti je 5 mg/kg.

2.    Princip

Vzorek se extrahuje směsí methanolu a vody. Po zředění mobilní fází a membránové filtraci se obsah amprolia stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s výměnou kationtů a UV detekcí.

3.    Činidla

13,80 g dihydrogenfosforečnanu sodného se rozpustí ve vodě (bod 3.3) v 1 000  ml odměrné baňce, doplní se vodou (bod 3.3) po značku a promíchá.

224,74 g chloristanu sodného se rozpustí ve vodě (bod 3.3) v 1 000  ml odměrné baňce, doplní se vodou (bod 3.3) po značku a promíchá.

Směs acetonitrilu (bod 3.2), roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného (bod 3.4) a roztoku chloristanu sodného (bod 3.5), 450 + 450 + 100 (v+v+v). Roztok se před použitím přefiltruje přes 0,22μm membránový filtr (bod 4.3) a odplyní (např. v ultrazvukové lázni (bod 4.4) po dobu nejméně 15 minut).

Do 100 ml odměrné baňky se s přesností na 0,1 mg naváží 50 mg amprolia (bod 3.7), rozpustí se v 80 ml methanolu (bod 3.1) a vloží se na 10 minut do ultrazvukové lázně (bod 4.4). Po vyjmutí z ultrazvukové lázně se roztok ochladí na laboratorní teplotu, doplní vodou po značku a promíchá. Roztok je při teplotě ≤ 4 °C stálý jeden měsíc.

Do 50 ml odměrné baňky se napipetuje 5,0 ml zásobního standardního roztoku (bod 3.7.1), doplní se po značku extrakčním rozpouštědlem (bod 3.8) a promíchá. Roztok je při teplotě ≤ 4 °C stálý jeden měsíc.

Do sady 50 ml odměrných baněk se odpipetuje postupně 0,5/1,0 a 2,0 ml pracovního standardního roztoku (bod 3.7.2). Doplní se po značku mobilní fází (bod 3.6) a promíchá. Tyto roztoky obsahují 0,5/1,0 a 2,0 g amprolia v 1 ml. Tyto roztoky se musí připravovat před použitím čerstvé.

Směs methanolu (bod 3.1) a vody, 2 + 1 (v+v)

4.    Přístroje

5.    Postup

5.1.    Obecně

5.1.1.    Slepý vzorek krmiva

Pro provedení zkoušky na výtěžnost (bod 5.1.2) se provede analýza pro kontrolu toho, že slepý vzorek krmiva neobsahuje ani amprolium, ani jiné rušivé látky. Slepý vzorek krmiva musí mít podobné složení jako vzorek a nesmí být zjištěno amprolium ani jiné rušivé látky.

5.1.2.    Zkouška na výtěžnost

Provede se zkouška na výtěžnost u slepého vzorku krmiva, který byl obohacen přidáním takového množství amprolia, které odpovídá jeho obsahu ve vzorku. Pro obohacení na obsah 100 mg/kg se převede 10,0 ml zásobního standardního roztoku (bod 3.7.1) do 250 ml kónické baňky a roztok se odpaří na objem přibližně 0,5 ml. Přidá se 50 g slepého vzorku krmiva. Důkladně se promíchá a vyčká 10 minut, znovu se několikrát promíchá a potom se se může začít s extrakcí (bod 5.2).

Není-li k dispozici slepý vzorek krmiva podobného složení jako vzorek (viz 5.1.1), lze provést zkoušku na výtěžnost metodou standardního přídavku. V tom případě se vzorek, jenž má být analyzován, obohatí přidáním takového množství amprolia, které odpovídá jeho obsahu ve vzorku. Tento vzorek se potom zkouší společně se vzorkem neobohaceným a výtěžnost se vypočte odečtením.

5.2.    Extrakce

5.2.1.    Premixy (obsah amprolia < 1 %) a krmiva

Podle obsahu amprolia se do 500 ml kónické baňky naváží 5–40 g vzorku s přesností na 0,01 g a přidá se 200 ml extrakčního rozpouštědla (bod 3.8). Baňka se vloží na 15 minut do ultrazvukové lázně (bod 4.4). Poté se baňka z ultrazvukové lázně vyjme a jednu hodinu třepe na třepačce nebo míchá na magnetické míchačce (bod 4.5). Alikvotní část extraktu se zředí mobilní fází (bod 3.6) na obsah amprolia 0,5–2 μg/ml a promíchá se (viz poznámka 9.3). 5–10 ml tohoto zředěného roztoku se přefiltruje přes membránový filtr (bod 4.2). Dále se pokračuje se stanovením HPLC (bod 5.3).

5.2.2.    Premixy (obsah amprolia ≥ 1 %)

Podle obsahu amprolia se do 500 ml kónické baňky naváží 1–4 g premixu s přesností na 0,001 g a přidá se 200 ml extrakčního rozpouštědla (bod 3.8). Baňka se vloží na 15 minut do ultrazvukové lázně (bod 4.4). Poté se baňka z ultrazvukové lázně vyjme a jednu hodinu třepe na třepačce nebo míchá na magnetické míchačce (bod 4.5). Alikvotní část extraktu se zředí mobilní fází (bod 3.6) na obsah amprolia 0,5–2 μg/ml a promíchá se. 5–10 ml tohoto zředěného roztoku se přefiltruje přes membránový filtr (bod 4.2). Dále se pokračuje se stanovením HPLC (bod 5.3).

5.3.    Stanovení HPLC

5.3.1.    Parametry:

Následující podmínky jsou doporučené, lze použít i jiné podmínky, pokud zajišťují rovnocenné výsledky.

Stabilita chromatografického systému se kontroluje opakovaným nástřikem kalibračního roztoku (bod 3.7.3), který obsahuje 1,0 μg/ml, dokud se nedosáhne konstantních výšek píků a konstantních retenčních časů.

5.3.2.    Kalibrační křivka

Provede se opakovaný nástřik každého kalibračního roztoku (bod 3.7.3) a stanoví se průměrná hodnota výšek (ploch) píků pro každou koncentraci. Kalibrační křivka se vytvoří vynesením průměrných hodnot výšek (ploch) píků kalibračních roztoků proti příslušným koncentracím v μg/ml.

5.3.3.    Roztok vzorku

Provede se opakovaný nástřik extraktu vzorku (bod 5.2) při použití stejného objemu jako u kalibračních roztoků a stanoví se průměrná hodnota výšek (ploch) píků amprolia.

6.    Výpočet výsledků

Z průměrné hodnoty výšky (plochy) píků amprolia u roztoku vzorku se podle kalibrační křivky (bod 5.3.2) stanoví koncentrace roztoku vzorku v μg/ml.

Obsah amprolia (w) v mg/kg ve vzorku se vypočte podle tohoto vzorce:

kde:

V

=

objem extrakčního rozpouštědla (bod 3.8) v ml podle bodu 5.2 (tj. 200 ml)

c

=

koncentrace amprolia v extraktu vzorku (bod 5.2) v μg/ml

f

=

faktor ředění podle bodu 5.2

m

=

hmotnost navážky vzorku v g

7.    Ověření výsledků

7.1.    Identita

Identitu analytu lze potvrdit simultánní chromatografií nebo využitím detektoru s diodovým polem, přičemž se porovnávají spektra extraktu vzorku (bod 5.2) a kalibračního roztoku (bod 3.7.3) obsahujícího 2,0 μg/ml.

7.1.1.    Simultánní chromatografie

Roztok vzorku (bod 5.2) je obohacen přidáním vhodného množství kalibračního roztoku (bod 3.7.3). Přidané množství amprolia musí odpovídat obsahu amprolia v extraktu vzorku.

Přídavek se projeví pouze zvýšením píku amprolia, a to úměrně k přidanému množství a ředění extraktu. Šířka píku v polovině výšky se smí odchylovat od šířky původního píku amprolia v neobohaceném extraktu vzorku nejvýše o ± 10 %.

7.1.2.    Detektor s diodovým polem

Výsledky jsou posuzovány podle těchto kritérií:

Jestliže některé z těchto kritérií není splněno, přítomnost analytu není potvrzena.

7.2.    Opakovatelnost

Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u téhož vzorku nesmí překročit:

7.3.    Výtěžnost

Výtěžnost u obohaceného (slepého) vzorku musí činit nejméně 90 %.

8.    Výsledky kolaborativní studie

Byla provedena kolaborativní studie, během níž byla analyzována tři krmiva pro drůbež (vzorky 1–3), jedno minerální krmivo (vzorek 4) a jeden premix (vzorek 5). Výsledky jsou uvedeny v této tabulce:

9.    Poznámky

I)   STANOVENÍ OBSAHU NARASINU

Obsah narasinu se stanoví takto:

J)   STANOVENÍ OBSAHU NIKARBAZINU

Obsah nikarbazinu se stanoví takto:

K)   STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU

Obsah dekochinátu se stanoví takto:

L)   STANOVENÍ OBSAHU MONENSINU

Obsah monensinu se stanoví takto:

M)   STANOVENÍ OBSAHU SALINOMYCINU

Obsah salinomycinu se stanoví takto:

N)   STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMYCINU

Obsah semduramycinu se stanoví takto:

O)   NORMY EN

Pro použití čl. 34 odst. 2 písm. a) nařízení (EU) 2017/625 jsou relevantní tyto normy EN: