(EU) č. 175/2010Nařízení Komise (EU) č. 175/2010 ze dne 2. března 2010 , kterým se provádí směrnice Rady 2006/88/ES, pokud jde o opatření pro omezení zvýšeného úhynu ústřic druhu Crassostrea gigas v souvislosti se zjištěním nákazy Ostreid herpesvirus 1 µvar (OsHV-1 µvar) (Text s významem pro EHP)

a) odebere vzorky v souladu s částí A přílohy I;

b) vyšetří je na výskyt viru OsHV-1 μvar v souladu s diagnostickými metodami stanovenými v části B přílohy I.

a) jsou určeny pro jinou uzavřenou oblast vytvořenou v souladu s čl. 2 odst. 2;

b) pocházejí z části uzavřené oblasti, která není postižena zvýšeným úhynem, včetně líhní, a zásilka byla podrobena:

c) jsou před použitím k lidské spotřebě určeny k dalšímu zpracování, pro střediska pro čištění, střediska pro odesílání nebo zpracovatelská zařízení, která jsou vybavena systémem čištění odpadních vod, který schválil příslušný orgán a který:

d) jsou určeny k lidské spotřebě a jsou zabaleny a označeny za tímto účelem v souladu s nařízením Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004 ( 4 ) a:

e) tyto zásilky nebo produkty v nich obsažené jsou určeny k lidské spotřebě bez dalšího zpracování, pokud jsou zabaleny v obalech pro maloobchodní prodej, které splňují ustanovení pro tyto obaly uvedená v nařízení (ES) č. 853/2004.

a) musí být doprovázeny veterinárním osvědčením vyplněným podle vzoru stanoveného v příloze II tohoto nařízení a vysvětlivek uvedených v příloze V nařízení (ES) č. 1251/2008, pokud jsou živočichové:

b) pocházejí z jednotky, kde byla na základě odběru vzorků a vyšetření provedených v souladu s částí A přílohy I prokázána nepřítomnost viru OsHV-1 μvar, a

c) splňují veterinární požadavky stanovené ve vzoru osvědčení uvedeném v písmeni a).

a) tento program musí být ohlášen Stálému výboru pro potravinový řetězec a zdraví zvířat;

b) toto ohlášení musí být v souladu s bodem 1, body 5.1, 5.2, 5.3, 5.5, a 5.9 a s body 6 a 7 vzorového formuláře stanoveného v příloze II rozhodnutí 2009/177/ES;

c) součástí programu musí být:

a) seznam uzavřených oblastí vytvořených v souladu s čl. 2 odst. 2 a faktorů, ke kterým se při určování těchto oblastí přihlíželo, včetně popisu geografických hranic příslušné oblasti;

b) seznam jednotek včetně popisu geografických hranic příslušné oblasti:

c) ohlášení týkající se programů uvedených v čl. 5 odst. 2 včetně popisu geografických hranic příslušné oblasti.

a) odběr vzorků pro účely čl. 3 odst. 2 písm. b) představuje:

Při výběru těchto živočichů musí být ve vzorku poměrně zastoupeny všechny části zásilky. Pokud jsou přítomni slabí, rozevření nebo právě uhynulí jedinci (kteří se ještě nerozkládají), vyberou se přednostně tito živočichové;

b) odběr vzorků pro účely čl. 5 odst. 2 představuje alespoň 150 jedinců ústřic Crassostrea gigas z každého místa odběru vzorků. Vzorky se odeberou ze všech hospodářství nebo chovných oblastí měkkýšů v členském státě nebo jednotce, na něž se program vztahuje.

Odběr vzorků pro účely čl. 5 odst. 1 písm. b) představuje alespoň 150 jedinců ústřic Crassostrea gigas z každé jednotky.

Při výběru těchto živočichů se přihlíží k těmto kritériím:

c) odběr vzorků stanovený v čl. 5 odst. 2 se provede během ročního období, kdy je prevalence viru OsHV-1 μvar v členském státě nebo jednotce prokazatelně nejvyšší. Pokud takové údaje nejsou k dispozici, odběr vzorků se provede bezprostředně po období, kdy teplota vody přesáhne 16 °C nebo v ročním období, kdy teplota běžně dosahuje svého ročního maxima;

d) odběr vzorků stanovený v čl. 5 odst. 1 písm. b) se pokud možno provede v ročním období popsaném v písmeni c). Pokud se vzorky odebírají v jiném než uvedeném ročním období, musí být odebrané ústřice uchovávány po dobu postačující k zjištění viru OsHV-1 μvar za podmínek, jež jsou rovnocenné podmínkám popsaným v písmeni c), než se provedou vyšetření.

— uzavřenou digestoř vybavenou systémem produkujícím UV záření za účelem odstranění možné kontaminace během přípravy směsi PCR,

— dvě úplné sady pipet (2 μl, 20 μl, 200 μl a 1 000 μl), jednu pro extrakci DNA a druhou pro přípravu směsi PCR,

— tři různé pipety: jednu o objemu 2 μl pro rozdělování vzorků ve směsi PCR, jednu o objemu 20 μl pro odběr vzorků ethidiumbromidu a jednu o objemu 20 μl pro zavádění produktů PCR do agarózového gelu,

— špičky pipet s filtrem (2 μl, 20 μl, 200 μl a 1 000 μl) pro extrakci DNA, přípravu směsi PCR a rozdělování vzorků,

— špičky pipet (20 μl) pro odběr ethidiumbromidu a pro zavádění amplifikačních produktů do agarózového gelu,

— termocykler pro provádění amplifikací,

— horizontální systém pro elektroforézu produktů PCR,

— UV tabulku pro pozorování produktů PCR po elektroforéze v agarózovém gelu,

— systém pro získání snímků gelů.

a) v případě larev se směsné vzorky o hmotnosti 50 mg celých živočichů (včetně skořápky) doplněné o 200 μl destilované vody rozdrtí a odstředí při 1 000 g po dobu 1 minuty;

b) v případě mladých ústřic menších než 6 mm se směsné vzorky o hmotnosti 300 mg celých živočichů (včetně skořápky) doplněné o 1 200 μl destilované vody rozdrtí a odstředí při 1 000 g po dobu 1 minuty;

c) v případě mladých ústřic o velikosti mezi 6 a 15 mm se všechny měkké tkáně každého živočicha rozdrtí samostatně;

d) v případě živočichů o velikosti nad 15 mm se izolují části žáber a pláště.

1. Do zkumavky mikroodstředivky o objemu 1,5 ml se v případě vzorků uvedených v písmenech a) a b) umístí 100 μl supernatantu a v případě vzorků uvedených v písmenech c) a d) 50 mg tkání a přidá se 180 μl pufru ATL.

2. Přidá se 20 μl proteinázy K, promíchá se na třepačce vortex a nechá se inkubovat při teplotě 56 °C, dokud se tkáň zcela nerozloží (přes noc). Během inkubace se několikrát promíchá na třepačce vortex, aby se vzorek rozptýlil. Zkumavka mikroodstředivky o objemu 1,5 ml se krátce odstředí, aby se z uzávěru odstranily kapky.

3. Ke vzorku se přidá 200 μl pufru AL, míchá se na pulzní třepačce po dobu 15 s a nechá se inkubovat při teplotě 70 °C po dobu 10 minut. Zkumavka mikroodstředivky o objemu 1,5 ml se krátce odstředí, aby se z uzávěru odstranily kapky.

4. Ke vzorku se přidá 200 μl ethanolu (96–100 %) a míchá se na pulzní třepačce po dobu 15 s. Zkumavka mikroodstředivky o objemu 1,5 ml se krátce odstředí, aby se z uzávěru odstranily kapky.

5. Směs vytvořená podle kroku 4 se opatrně umístí do kolony QIAamp (do zkumavky o objemu 2 ml), aniž se zvlhčí okraj. Uzavře se a odstřeďuje při 10 000 ot/min po dobu 1 minuty. Kolona QIAamp se umístí do čisté zkumavky o objemu 2 ml (která je obsahem soupravy) a zkumavka obsahující filtrát se odstraní.

6. Kolona QIAamp se opatrně otevře a přidá se 500 μl pufru AW1, aniž se zvlhčí okraj. Uzavře se a odstřeďuje při 10 000 ot/min po dobu 1 minuty. Kolona QIAamp se umístí do čisté zkumavky o objemu 2 ml (která je obsahem soupravy) a zkumavka obsahující filtrát se odstraní.

7. Kolona QIAamp se opatrně otevře a přidá se 500 μl pufru AW2, aniž se zvlhčí okraj. Uzavře se a odstřeďuje při plné rychlosti (14 000 ot/min) po dobu 3 minut.

8. (Nepovinné) Kolona QIAamp se umístí do nepoužité zkumavky o objemu 2 ml (která není obsahem soupravy) a zkumavka obsahující filtrát se odstraní. Uzavře se a odstřeďuje při plné rychlosti (14 000 ot/min) po dobu 1 minuty.

9. Kolona QIAamp se umístí do čisté zkumavky mikroodstředivky o objemu 1,5 ml (která není obsahem soupravy) a zkumavka obsahující filtrát se odstraní. Kolona QIAamp se opatrně otevře a přidá se 100 μl destilované vody. Nechá se 5 minut inkubovat při laboratorní teplotě a odstřeďuje se při 10 000 ot/min po dobu 1 minuty.

10. Kvalita a účinnost extrakce se sleduje pomocí spektrofotometru nebo po elektroforéze v agarózovém gelu (například měřením optické hustoty (260 nm)).

11. Vzorky se zředí tak, aby konečná koncentrace DNA činila 50–100 ng/μl.

12. Roztoky DNA se až do provedení analýzy PCR uchovávají při teplotě 4 °C.

— pufr 10 X (s polymerázou Taq DNA),

— MgCl2 (s polymerázou DNA) (25 mM),

— polymeráza Taq DNA (Goldstar, Eurogentec) 5 U/μl,

— dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTT) Master Mix (20 mM), před použitím desetinásobně zředěný (na 2 mM),

— d H2O (destilovaná H2O bez DNA a RNA).

CF (10 μM),

CR (10 μM).

— 49 μl této směsi PCR se umístí do každé zkumavky PCR,

— do každé zkumavky se přidá 1 μl extrahované DNA (50–100 ng/μl).

— negativní kontroly se skládají z dH2O (1 μl na 49 μl směsi PCR). Cílem je zjistit možnou reaktivní kontaminaci nebo reaktivní pracovní prostředí. Měla by být provedena jedna negativní kontrola na každých 10 vzorků nebo na každou sérii vzorků,

— pozitivní kontroly se skládají z plazmidické DNA obsahující region CF-CR cílového genomu OsHV-1. Cílem je kontrola účinnosti reakce PCR. Měla by být provedena jedna pozitivní kontrola na každou analýzu PCR. Pozitivní kontroly jsou k dispozici v referenční laboratoři Společenství.

— počáteční denaturace: 2 min při 94 °C,

— amplifikace: 35 cyklů (1 min při 94 °C, 1 min při 50 °C a 1 min při 72 °C),

— konečná elongace: 5 min při 72 °C.

— 50 X TAE (lze zakoupit jako připravený k použití):

— agarózový gel 2,5 % v 1X TAE,

— ethidiumbromid (0,5 μg/ml) přidaný po zchladnutí gelu,

— zavádění modrého barviva:

— marker molekulové hmotnosti:

— SmartLadder SF (Eurogentec): marker molekulové hmotnosti připravený k použití včetně 9 rovnoměrně dělených pruhů od 100 do 1 000 bp.

1. Naváží se 2,5 g agarózy, přidá se 100 ml 1X TAE a zahřívá se, dokud se směs nerozpustí.

2. Po vychladnutí roztoku se přidá ethidiumbromid (5 μl na 100 ml agarózového gelu) a roztok se umístí do zvláštní vany vybavené hřebínky (aby se vytvořily jamky).

3. Poté, co se gel polymerizuje, hřebínky se odstraní a gel se umístí do horizontálního systému pro elektroforézu, který obsahuje dostatečné množství 1X TAE pro to, aby byl agarózový gel zcela pokryt.

4. 10 μl produktů PCR se smísí s 2 μl modrého barviva (6X) a umístí do jamek.

5. Jedna jamka je určena pro marker molekulové hmotnosti (5 μl).

6. Použije se napětí v rozsahu 50–150 voltů po dobu 30 minut až 1 hodiny v závislosti na množství a tloušťce gelu.

7. Gel se pozoruje pod UV zářením.

a) počet a rozšíření měkkýšů v nakaženém hospodářství nebo v nakažené chovné oblasti měkkýšů;

b) vzdálenost a hustota sousedních hospodářství nebo chovných oblastí měkkýšů;

c) blízkost ke zpracovatelským zařízením, kontaktním hospodářstvím nebo kontaktním chovným oblastem měkkýšů;

d) druhy přítomné v hospodářstvích nebo chovných oblastech měkkýšů;

e) chovné postupy používané v postižených a sousedních hospodářstvích nebo chovných oblastech měkkýšů a

f) hydrodynamické podmínky a jiné faktory epizootologického významu.